通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的rna干擾使cd59沉默以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷在卵巢癌中的作用

1、通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的干擾 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的干擾 RNA RNA 使 CD59 CD59 沉默以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞 沉默以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷在卵巢癌中的作用 損傷在卵巢癌中的作用史雪香，張蓓，張錦林，王國(guó)英，高美華CD59 屬于膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（mCRPs） ，它能夠抑制補(bǔ)體的殺傷活性并且在卵巢癌等一些實(shí)體癌中過(guò)度達(dá)。本研究的目的是以人 CD59 為靶向構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼 shRNA 并且感染 A2780 細(xì)胞，以探討 CD59

2、低表達(dá)和卵巢癌發(fā)生之間的關(guān)系。分別成功構(gòu)建重組載體 siCD59 和 siCD59-C 經(jīng) PCR 鑒定、限制性內(nèi)切酶分析和 DNA 測(cè)序。siCD59 能夠有效感染 A2780 細(xì)胞，并可由 Western 印跡證實(shí)。siCD59-C 感染的 A2780細(xì)胞與 siCD59 感染的細(xì)胞用新鮮正常人血清（8％，V / V）在 37℃下培育 1 小時(shí)，發(fā)現(xiàn) siCD59-C 感染的A2780 細(xì)胞與 siCD59 感染的細(xì)胞相比細(xì)胞活

3、力降低并且細(xì)胞損傷增加。它可導(dǎo)致 caspase-3 的活化。通過(guò)對(duì)高度濃縮細(xì)胞核 Hoechst 染色可發(fā)現(xiàn) siCD59 感染的細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象。同時(shí)，siCD59 組與 siCD59-C組相比，裸鼠卵巢腫瘤移植物的重量顯著降低。siCD59 組中裸鼠腫瘤組織的 CD59 蛋白表達(dá)也顯著降低。結(jié)果表明，在卵巢癌細(xì)胞中可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的 RNA 干擾使 CD59 沉默以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制卵巢癌的生長(zhǎng)。所以 CD59 有

4、可能會(huì)成為卵巢癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。細(xì)胞與分子免疫學(xué)。 2009；6（1）：61-66關(guān)鍵詞：CD59，補(bǔ)體，RNA 干擾，基因治療，卵巢癌介紹 介紹補(bǔ)體是固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗感染作用的重要組成部分，同樣在腫瘤的生長(zhǎng)中也發(fā)揮著重要作用（1） 。CD59 屬于膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（mCRPs） ，阻斷膜攻擊復(fù)合物（MAC）的形成，從而抑制補(bǔ)體的殺傷活性（2，3） 。有研究表明，大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤中 CD59 的表達(dá)高于正常組織，這有助于惡性細(xì)胞逃

5、避免疫監(jiān)視和補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用，并限制了補(bǔ)體結(jié)合單克隆抗體發(fā)揮作用（4-7） 。腫瘤細(xì)胞免疫逃逸是導(dǎo)致免疫療法失敗的主要原因。阻斷腫瘤細(xì)胞表面 CD59 功能可使補(bǔ)體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞有效清除并可前瞻性的提高補(bǔ)體活化抗腫瘤抗體的作用（8,9） 。經(jīng)報(bào)導(dǎo)已有不同技術(shù)用于抑制 CD59 的表達(dá)及功能，例如通過(guò)中和抗體、反義寡核苷酸或合成 siRNA 靶向 CD59 或使用一些方法影響 CD59 表達(dá)的調(diào)控（11） 。然而，CD59 耗竭對(duì)腫瘤

6、細(xì)胞生長(zhǎng)的影響到目前為止還沒(méi)有很好的定義。本研究的目的是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的 siRNA 使卵巢癌細(xì)胞系中 CD59 沉默表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)查 CD59 消耗對(duì)人工培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響和對(duì)植入卵巢癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的 siRNA 在補(bǔ)體的幫助下幾乎可以完全抑制卵巢癌細(xì)胞系中 CD59 蛋白的表達(dá)，使人工培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞系細(xì)胞活力降低和細(xì)胞凋亡增加，同樣可以抑制裸鼠體內(nèi)卵巢腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些結(jié)果

7、表明，CD59 沉默可以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，抑制卵巢癌的生長(zhǎng)。 CD59 可能會(huì)作為在卵巢癌基因治療中的潛在靶點(diǎn)。材料和方法 材料和方法材料 材料pSUPER、GFP 載體是由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)邴羅博士好心提供的。人卵巢癌細(xì)胞系（A2780）從中國(guó)社科院購(gòu)買。 BGL II，Hind III，EcoR I 和 T4 DNA 連接酶來(lái)自 Fermentas。 E.Z.N.A.凝膠提取試劑盒來(lái)自O(shè)MEGA。 RPMI 1

8、640 和 DMEM 從 GIBCO（蓋瑟斯堡，MD，USA）購(gòu)買。;脂質(zhì)體 2000 來(lái)自 InvitrogenTM Life Technologies 公司。所用鼠抗人 CD59 抗體從 BD PharMingen 公司購(gòu)買。LDH 試劑盒來(lái)自南京建成生物工程研究所。新鮮正常人血清（NHS）是在實(shí)驗(yàn)室中從健康志愿者的血液中獲得的。18 只 5-6 周齡雌性裸鼠由北京市利華動(dòng)物基金提供，無(wú)特定病原體的條件下被培養(yǎng)，并保持在恒定濕度和溫

9、度。其它化學(xué)品和可用試劑均為當(dāng)?shù)厣虡I(yè)來(lái)源。 根據(jù)染色溶液制造商（中國(guó)江蘇碧云天）的說(shuō)明使用 Hoechst 33258 染色的方法對(duì)核形態(tài)進(jìn)行研究。（12） 。凋亡細(xì)胞以核形態(tài)的變化為基礎(chǔ)進(jìn)行定義，如染色質(zhì)凝聚和碎裂。研究人員利用無(wú)偏性體視學(xué)和奧林巴斯熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）通過(guò)手工計(jì)數(shù)的方法計(jì)算所有核染色質(zhì)凝集的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)每個(gè)孔我們劃定一個(gè) 400 平方微米框架，并且在所劃定的至少十個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)計(jì)算所有核固縮和正常的細(xì)胞數(shù)目

10、，核固縮和核正常的細(xì)胞數(shù)目的平均總和來(lái)計(jì)算每孔中細(xì)胞總數(shù)目，該數(shù)據(jù)用來(lái)計(jì)算核固縮細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。異種移植研究 異種移植研究A2780 細(xì)胞在不含抗生素和血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中洗滌兩次，最后細(xì)胞重新以 5×10^6 個(gè)/0.2ml 的密度懸浮于生理鹽水（NS）中。該細(xì)胞懸浮液經(jīng)皮下注射到裸鼠體內(nèi)（9 只小鼠一組，2 組） ，并將其在 6 周后處死。切除腫瘤并稱重，在 10％福爾馬林中固定 24 小時(shí)，并用

11、 PBS 溶液洗滌。按照上述描述的方法（13）將腫瘤樣品進(jìn)行抗 CD59 抗體免疫組化處理（1：400） ，然后進(jìn)行石蠟固定。每免疫組化組大約有1,000 個(gè)細(xì)胞，結(jié)果取 9 組的均值。統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)分析以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差記錄數(shù)據(jù)。采用 t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。p<0.05 被認(rèn)為顯著差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 結(jié)果表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定利用 Bgl II 和 Hind III 限制性內(nèi)切酶剪切 Bgl II/

12、HindIII (2424/1441 基因位點(diǎn))片段，約 983 個(gè)堿基對(duì)，完成對(duì)空載體的修飾，形成線性載體。接著，將退火后的具有產(chǎn)生人 CD59 相同序列的寡核苷酸下游插入 H1 啟動(dòng)子，并用 5 個(gè)胸苷作為終端的信號(hào)。我們?cè)O(shè)計(jì)了識(shí)別該重組載體的引物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包含395 個(gè)堿基對(duì)，由插入的 60 個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸和雙側(cè)序列 pSUPER 構(gòu)成。引物序列如下：pSUPER-a：5'CCT TTA TCC AGC CC

13、T CAC TC-3'，pSUPER-s：5'-AGA CTG CCT TGG GAA AAG CG-3'。我們把空重組載體作為模板來(lái)擴(kuò)增。陽(yáng)性克隆包含 395 個(gè)堿基對(duì)，陰性克隆包含 1318（395 - 60 + 983）個(gè)堿基對(duì)（圖 1A） 。此外，空重組載體經(jīng) EcoRⅠ（2645 點(diǎn)）和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化，除去包含 1204（2645-1441）個(gè)堿基對(duì)的空載體片段，重組載體片