腺病毒介導(dǎo)的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子二步轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)系統(tǒng)Htertp-TSTA在卵巢癌中轉(zhuǎn)錄活性的研究.pdf

1、研究背景:卵巢上皮細(xì)胞癌目前仍是嚴(yán)重威脅廣大婦女健康的惡性腫瘤。尋求傳統(tǒng)手術(shù)、放化療之外的新的療法十分必要。在卵巢癌的生物治療中，基因治療備受矚目。已有愈來愈多的轉(zhuǎn)基因治療進(jìn)入臨床研究。為了防止促凋亡基因?qū)φ＜?xì)胞的毒性作用，實現(xiàn)治療基因在腫瘤組織中的靶向表達(dá)十分必要。應(yīng)用腫瘤特異性啟動子(TSP)對治療基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，再通過對病毒包膜基因進(jìn)行修飾，改變病毒對細(xì)胞的CAR嗜性為整合素嗜性，來提高病毒對卵巢癌細(xì)胞的感染水平，是行之有

2、效的方法之一。
　　 研究目的:檢測hTERT啟動子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)系統(tǒng)(TSTA-hTERTp)在卵巢癌細(xì)胞及正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 研究方法:應(yīng)用Ad-Max系統(tǒng)將各重組腺病毒載體包裝成重組腺病毒并鑒定、純化及擴(kuò)增。
　　 應(yīng)用熒光顯微鏡檢測各啟動子系統(tǒng)調(diào)控下表達(dá)EGFP的重組腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、HO8910，SKOV3，宮頸癌細(xì)胞系Hela及正常人臍血內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304后EGFP的表達(dá)情況

3、，應(yīng)用CCK-8試劑可簡便而準(zhǔn)確的進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的熒光激活細(xì)胞分類器(FACS)對感染的不同細(xì)胞進(jìn)行熒光定量檢測，檢測細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、載體構(gòu)建與病毒制備：成功制備RGD修飾型腺病毒載體CTD010-1及CTD011-4;成功制備表達(dá)CMV啟動子啟動子及TSTA-hTERTp調(diào)控下EGFP的重組腺病毒，分別命名為Ad-EGFP和Ad-hTERT-TSTA-EGFP。<

4、br>　　 2、各啟動子系統(tǒng)在卵巢癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性：Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、HO8910和宮頸癌細(xì)胞系Hela中的EGFP陽性細(xì)胞數(shù)和綠色熒光強(qiáng)度均高于Ad-EGFP感染者。其中hTERT活性相對較高的OVCAR3、HO8910和Hela細(xì)胞經(jīng)Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后其EGFP表達(dá)水平分別是Ad-EGFP感染后的4倍、1.6倍和2.6倍；SKOV3細(xì)胞經(jīng)Ad-h

5、TERT-TSTA-EGFP感染后的EGFP表達(dá)水平較低，但經(jīng)Ad-EGFP感染后的EGFP的表達(dá)水平與OVCAR3、HO8910和宮頸癌細(xì)胞系Hela無明顯差異。在hTERT活性極低的ECV304中，Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后的EGFP表達(dá)水平只相當(dāng)于背景水平，相當(dāng)于Ad-EGFP感染的0.0067倍。
　　 研究結(jié)論:TSTA-hTERTp系統(tǒng)可以顯著增強(qiáng)其在hTERT陽性的卵巢癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，而不增強(qiáng)其