bcr-abl逆轉錄病毒介導的小鼠慢性粒細胞白血病樣模型的建立.pdf

1、慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于異常多能造血干細胞的克隆增殖性疾病，bcr/abl融合基因的持續(xù)表達在該病的形成過程中起重要作用。目前，國內對CML發(fā)病機制和治療的研究主要選用含有bcr/abl融合基因的體外細胞模型、bcr/abl轉化的造血細胞株在小鼠體內的定殖模型或K562細胞移植裸鼠成皮下瘤后，再接種到免疫缺陷小鼠建立CML模型鼠的方法。而利用逆轉錄病毒介導的小鼠骨髓轉導、移

2、植模型研究人類CML的發(fā)生、發(fā)展及其生物學特性，是20世紀90年代以來國外該領域研究的新進展。 國內尚未見相關報道。本課題以bcr/ab逆轉錄病毒Mig210為載體，經(jīng)包裝細胞包裝后收集病毒上清并測定滴度，感染經(jīng)5-FU預處理的Balb/c雄性小鼠骨髓細胞，再回輸?shù)浇?jīng)致死劑量γ射線照射后的同種雌性受體鼠中，首次成功建立了CML小鼠移植模型。并在此基礎上又建立了再次移植模型。其主要方法、結果及結論如下： 1.bcr/ab逆

3、轉錄病毒介導的慢性粒細胞白血病樣小鼠模型的首次建立。 含bcr/abl癌基因的逆轉錄病毒Mig210載體經(jīng)Phoenix-Ampo細胞包裝后，收集病毒上清液并測定其滴度后感染經(jīng)5-FU預處理的Balb/c雄性小鼠骨髓細胞，再經(jīng)尾靜脈移植入經(jīng)致死劑量γ射線(900cGy)照射的同種雌性受體鼠中后，通過外周血和骨髓細胞形態(tài)學、肝臟和脾臟組織學觀察,RT-PCR和western blot分別檢測 bcr/abl在mRNA和蛋白水平的表

4、達情況，鑒定小鼠成模狀況。移植8～9周后，外周血白細胞達(20～30)×1010/L(為對照鼠的5～8倍)，外周血涂片幼稚細胞達到10％～20％；骨髓粒系細胞顯著增高，易見幼稚細胞，肝脾也可見白血病細胞浸潤；移植4～5周后在受體鼠骨髓和脾臟檢出bcr/abl融合基因,8～9周后在肝臟檢測出bcr/abl融合基因，同時在骨髓和脾臟也檢測到BCR/ABL融合蛋白，建模成功的小鼠3～5月后相繼死亡。 為了提高CML成模率，在實驗過程中

5、還優(yōu)化和改進了方法：用纖維連接蛋白作基質進行病毒上清和骨髓細胞的共感染，使活細胞增加20％～30％，且更易附著于瓶底，細胞狀態(tài)也更好；用2mg～10mg/10g的5-FU預處理雄性供體Balb/c小鼠，對小鼠骨髓原始細胞相對數(shù)量無明顯性影響；回輸給受體鼠感染了病毒的骨髓細胞數(shù)量分別為0.2×106個、0.4×106個、0.6×106個和1.0×106個時，小鼠CML成模率分別為60％、80％、90％和90％。 2.bcr/ab1

6、逆轉錄病毒介導的小鼠CML二次移植模型的建立。 收集成功建模的CML小鼠模型的骨髓細胞或脾細胞，經(jīng)尾靜脈輸入經(jīng)亞致死劑量γ射線(450cGy)照射的同種雌性受體鼠中，通過脾集落形成實驗、骨髓形態(tài)學觀察、Y染色體及其特異性性別決定基因Sry檢測、bcr/ab1在mRNA和蛋白水平的表達情況，分析鑒定CML小鼠二次移植模型成模情況。結果顯示：移植后12天，肉眼可見明顯的脾結節(jié)形成，連續(xù)切片可見成堆脾集落；移植4～5周后，在雌性受體小

7、鼠骨髓中檢出相似Y染色體及Y染色體特異性Sry基因，骨髓和脾臟中檢出bcr/abl融合基因；移植6～8周后外周血白細胞升高至正常未處理小鼠的4～8倍，粒系明顯增高至20～32×109個/L；外周血涂片幼稚細胞達10％～20％；骨髓涂片結果顯示粒系顯著增高，易見幼稚細胞，肝脾也可見白血病細胞浸潤，同時，在肝臟檢測出bcr/abl融合基因；骨髓檢測到BCR/ABL融合蛋白的表達；移植后18周后，外周血涂片幼稚細胞30％以上，小鼠發(fā)生急變，最