與 SmpB 蛋白相結合的特異肽適體 PA-1的篩選及其降低維氏氣單胞菌毒力的分子機制研究.pdf

1、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是一種重要的人-魚共患致病菌，廣泛存在于各種水體、淤泥和土壤環(huán)境中，能夠感染多種水產養(yǎng)殖動物，同時也能夠引起免疫力低下患者急性腹瀉、敗血癥、腦膜炎等，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失，對人類健康也構成威脅。但迄今為止，關于維氏氣單胞菌疫苗研發(fā)的基礎研究還很薄弱。為此，本研究采用細菌雙雜交、分子克隆、實時熒光定量PCR、細菌單雜交等技術，以維氏氣單胞菌滯留核糖體拯救主要伴侶蛋白Small pr

2、otein B（SmpB）為靶標，對與其相結合的特異性肽適體及其作用機制等進行了研究，所獲得主要研究結果具體如下：
　　1、與SmpB蛋白相結合的高特異、高親和力肽適體的篩選與鑒定。采用細菌雙雜交技術，從金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase）為骨架蛋白構建的肽適體文庫中篩選出與SmpB蛋白高特異、高親和力結合的肽適體PA-1。誘導表達SmpB、骨架蛋白SNase和肽適體PA-1蛋白，利用酶聯免疫的方法，證實肽適體PA-1與SmpB在體

3、外具有結合特異性，其解離常數（dissociation constant）Kd值為0.69μM，相比SN結合SmpB的Kd1.380μM，具有更高的親和力。SmpB N-端34以及C端30氨基酸殘基，與肽適體PA-1表面突環(huán)有很強的相互作用，其中SmpB與肽適體PA-1相互作用的關鍵位點為T14I15、F26I27和D138K139R140。
　　2、基于肽適體PA-1的維氏氣單胞菌減毒株的構建及功能研究。利用細菌雙親接合，將肽適

4、體骨架蛋白SN的表達質粒pN-SN、肽適體PA-1表達質粒pN-PA-1及空載體pRE112導入維氏氣單胞菌。結果顯示，與野生型或轉化空質粒相比較，導入質粒pN-PA-1的維氏氣單胞菌生長十分緩慢，在0.0％-5.0% NaCl，2.5 mM CaCl2和25 mM MgCl2存在下非常敏感。斑馬魚（Danio rerio）半致死濃度LD50分析結果表明，含PA-1表達質粒(pN-PA-1)的A. veronii C4較野生型毒力降低約

5、33倍；腹腔注射免疫斑馬魚，酶聯免疫法檢測到IgM抗體在14天時達到最高，并持續(xù)到28天；在攻毒實驗中，免疫組表現出65%的相對免疫保護率，具備減毒活疫苗的特性。由此說明，肽適體PA-1可導致維氏氣單胞菌毒力水平顯著下降，對減毒活疫苗的研發(fā)具有重要的指導意義。
　　3、肽適體PA-1導致維氏氣單胞菌毒力水平下降的分子機制研究。采用實時熒光定量PCR檢測外膜蛋白ompA、toloC基因、氣溶素aer基因等的轉錄水平變化。結果顯示，各

6、維氏氣單胞菌中smpB基因轉錄水平基本不變，而導入PA-1的維氏氣單胞菌ompA等毒力基因轉錄水平顯著下調。提示，PA-1可能與維氏氣單胞菌 SmpB 為了進一步探討 SmpB是否可以調控上述表達下調基因的表達，本研究選取 ompA基因進行研究。通過細菌單雜交以及凝膠滯緩實驗證實SmpB可以作為轉錄因子高親和力結合在外膜蛋白ompA啟動子區(qū)，DNA足跡法顯示SmpB蛋白結合在ompA啟動子的-35區(qū)上游，且在Mg2+輔助下促進

7、ompA轉錄，維持細菌毒力水平，細菌雙雜交顯示SmpB蛋白和外膜蛋白OmpA沒有相互作用。由此說明，SmpB可能作為一種轉錄因子參與對 ompA表達的調控。
　　綜上所述，本研究主要發(fā)現一種新的與維氏氣單胞菌SmpB蛋白相結合的肽適體PA-1，其可通過阻遏SmpB蛋白功能的發(fā)揮下調ompA等相關基因的表達而導致維氏氣單胞菌生存能力以及毒力水平的下降。所獲研究結果為開發(fā)維氏氣單胞菌減毒活疫苗奠定了基礎，并對以SmpB為抑菌靶標，開發(fā)