dna的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和方法步驟

1、DNA DNA 的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和方 的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和方法步驟 法步驟瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純 DNA 片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA 在堿性條件下（pH8 0 的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同 DNA 分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入 DNA 分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物

2、，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。…一、 一、實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?目的學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖電泳法鑒定 DNA 的原理和方法。二、 二、實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 原理瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純 DNA 片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA 在堿性條件下（pH8.0 的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同 DNA 分子片段由于

3、分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入 DNA 分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。三、 三、實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)材料 材料實(shí)驗(yàn) 14 提取的 DNA 樣品，四、器具及 四、器具及藥品電泳儀，電泳槽，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進(jìn)樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍(lán)，溴化乙錠。五、 五、實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟1、安裝電泳槽將有

4、機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。2、瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，（按 0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb 大小的 DNA 用1%的凝膠，20-100kb 的 DNA 用 0.5%的凝膠，200-2000bp 的 DNA 用 1.5%的凝膠）置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化（不要加熱至沸騰），取出搖勻。3、灌膠將冷卻到 60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上

5、。4、待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。5、加樣將 DNA 樣品與加樣緩沖液（loading buffer）按 4：1 混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加 10-20μl，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。6、電泳安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至 3-5V/cm，電泳 1-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿 1-2cm 時(shí)，停止電泳。7、染色和觀察取出凝膠，放在含有溴化乙錠的

6、染色液中染色 30min，即可在 254nm 的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為 DNA 條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時(shí)要小心，必須戴手套。附：⑴5×TBE（tris-硼酸及 EDTA）緩沖液的配制(1000ml)：Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5mol/LEDTA 20ml，將 pH 調(diào)到 8.0，定容至 1000ml，4℃冰箱保存，用時(shí)稀釋 10 倍。⑵加樣緩沖液的配制：0

7、.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。⑶溴化乙錠的配制：稱取 0.1g 溴化乙錠，溶于 10ml 水，配成終濃度為 10mg/ml 的母液，4℃冰箱保存。染色時(shí)，吸取 12.5μl 的母液，加入 250ml 的水中，使其終濃度為 0.5μg/ml，混合均勻。⑷100 倍 TE 緩沖液的配制：1mol/LTris-HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA稱取 Tris121.1g，EDTA-Na237.23g，

8、先用 800ml 雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調(diào)pH 至 8.0（大約加入鹽酸 20ml），然后定容至 1000ml。⑸100 倍電泳緩沖液的配制：4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L 醋酸鈉，200mmol/LEDTA稱取 Tris242.2g，無水乙酸鈉 82.03g，EDTA-Na237.23g，先用 400ml 雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào) pH 至 8.0（大約加入冰乙酸 50ml），然后定容至