牙鲆腸道乳桿菌新種lactobacillussp.nov表面粘附蛋白的研究

1、單位代碼 1 0 4 4 S學(xué)號(hào) 2 0 0 2 1 4 3 0分類號(hào) Q 9 3 6Y ’ 7 6 4 5 1 6彥孝存缸大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目：牙鲆腸道乳桿菌新種( L a c t o b a c i l l u ss p ．n o v )表面粘附蛋白的研究學(xué)科專業(yè)名稱：申請人姓名：指導(dǎo)教師：細(xì)厘生物堂 掰山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 0 0 5 年5 月采鏹渺 匆薔i Z 善鎏q 焉山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文牙鲆腸道乳桿菌新種( L

2、 a c t o b a c i l l u s s p ．n o v )表面粘附蛋白的研究中文摘要益生乳酸菌在腸道中的定植能夠排斥外來病原菌的入侵，從而起到生物抗菌的作用。粘附過程是乳酸菌定植的第一步，由于菌體表面的各種粘附相關(guān)成分是介導(dǎo)粘附的基礎(chǔ)，從而對這些成分的研究分析是闡明益生菌粘附機(jī)理的必要條件，而粘附枧理的深入研究對于消化道微生態(tài)環(huán)境豹改善以及病原菌的生態(tài)防治均具有熏要意義。本文以從健康牙鲆腸道中分離篩選的乳桿菌新種L 1

3、5 為實(shí)驗(yàn)材料，對其參與粘附過程的表面蛋白質(zhì)成分進(jìn)行了初步的分離、分析鑒定和純化。首先進(jìn)行細(xì)菌生長曲線的測定。在3 7 ℃液體M R S 培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)條件下，L 1 5 生長的潛伏期為6 h ，此后進(jìn)入對數(shù)生長期，至1 8 h 到達(dá)穩(wěn)定期。通過比較5 m o l ／L 酸性氯化鋰、5 m o l ／L 中性氯化鋰、8 m o l ／L 尿素三種不同的試劑，選定了提取蛋白種類和數(shù)量相對較多的5 m o I ／L 中性氯化鋰進(jìn)行表面蛋白質(zhì)

4、的提取。在不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基鹽度實(shí)驗(yàn)條件下，5 m o l ／L 中性氯化鋰提取得到的L 1 5 表麗蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量都有較大的差異，通過比較，選定了在M R S 培養(yǎng)基中3 7 ℃靜置培養(yǎng)1 6 h 的培養(yǎng)條件。5 m o l ／L 中性氯化鋰處理前后的菌體掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，雖然L 1 5 由原來的二連體狀態(tài)變?yōu)榉稚⒌膯误w狀態(tài)，但是細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而且在上述培養(yǎng)和提取條件下，表面蛋白提取前后L 1 5 對牙鲆腸粘

5、液的粘附能力有較大變化，表明提取的蛋白質(zhì)為表面蛋白質(zhì)，而且在表面蛋白質(zhì)中存在參與腸粘液粘附的成分。采用蛋白質(zhì)印跡法( W e s t e r n b l o t t i n g ) 鑒定L 1 5 中參與粘附的表面蛋白質(zhì)成分，即牙鲆腸粘液經(jīng)酯化生物素( B ．m - I S ) 處理后，與轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的L 1 5 表面蛋白質(zhì)共同孵育，再經(jīng)過與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素( H R P ．A v i d i n ) 的作用，D A

6、B 顯色顯示出菌體表面參與秸附的蛋白質(zhì)只有一種，分子量為6 1 ．8 k D a ，將之命名為M A P P p o l 。同樣，利用B ，N H S 標(biāo)記L 1 5 全蛋白后，與轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的牙鲆腸粘液蛋白共同孵育，再經(jīng)H R P - A v i d i n 和D A B 的作用，結(jié)果顯示牙鲆腸粘液中存在兩種分子量接近的蛋白質(zhì)一2 9 ．7 k D a 和3 0 ．3 k D a - - 參與了粘附過程。上述結(jié)果證明，L t