鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的熒光免疫分析研究及應用.pdf

1、環(huán)境激素是一類會使人類及生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生紊亂的外來物質(zhì)。它可以改變?nèi)祟惡蜕锏膬?nèi)分泌系統(tǒng)，導致生殖、發(fā)育和行為異常。鄰苯二甲酸酯類化合物是一類重要的環(huán)境激素。主要作為增塑劑，應用于食品和建筑行業(yè)。實驗數(shù)據(jù)顯示很多鄰苯二甲酸酯類化合物影響動物體的生殖和發(fā)育系統(tǒng)。
　　 近年來，隨著塑料制品的大量生產(chǎn)和使用，鄰苯二甲酸酯不斷進入環(huán)境，已成為全球性的最普遍的一類環(huán)境污染物。廣泛存在于大氣、水體、土壤、生物體等自然環(huán)境中，在普通人群

2、中均可檢測到。
　　 目前對鄰苯二甲酸類環(huán)境激素的監(jiān)測主要有氣相色譜、液相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用等技術。但色譜技術耗時長，所需設備昂貴。所以，很有必要開發(fā)一系列簡單、快速、可靠、靈敏、花費低廉的檢測鄰苯二甲酸類環(huán)境激素的方法。免疫分析具有方便快捷、檢測成本低、安全可靠等優(yōu)點可以滿足簡單、快速、靈敏檢測環(huán)境激素的要求。國內(nèi)外有關免疫分析方法監(jiān)測鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的較少。
　　 本文意在建立一系列檢測環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸酯類環(huán)境

3、激素的免疫分析方法。選擇5種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素(鄰苯二甲酸二甲酯，鄰苯二甲酸二乙酯，鄰苯二甲酸二丙酯，鄰苯二甲酸二丁酯，鄰苯二甲酸二環(huán)己酯)作為研究對象，主要通過半抗原衍生物的設計和制備、全抗原和抗體的制備與表征，采用熒光免疫技術，建立了一系列快速靈敏檢測鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的免疫分析方法，并應用于實際樣品的測定。本工作取得了以下結(jié)果：
　　 ⑴以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，與丙醇發(fā)生酯化反應后，再通過還原反應，在鄰苯二甲酸

4、二丙酯的苯環(huán)上引入了氨基并保持了酯基結(jié)構(gòu)。首次合成了鄰苯二甲酸二丙酯半抗原衍生物，并通過1HNMR，IR和UV進行了表征；
　　 ⑵采用新的合成技術和提純方法，在4種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的苯環(huán)上引入了氨基。合成了鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯等4種酯的半抗原衍生物，各步產(chǎn)物均經(jīng)1HNMR，IR和UV圖譜分析確證；
　　 ⑶合成的5種半抗原衍生物通過與載體蛋白BSA偶聯(lián)，制備了鄰

5、苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯等5種酯的新的人工全抗原，經(jīng)熒光光譜、體系顏色變化和免疫實驗確證偶聯(lián)成功；
　　 ⑷通過免疫新西蘭大白兔，對血清進行分離和提純，制備了5種效價高、特異性好的抗鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的新抗體IgG；
　　 ⑸將制備和提純的抗體應用于這五種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的檢測，首次建立了2種檢測鄰苯二甲酸二乙酯、1種檢測鄰苯二甲酸二甲酯，1種檢測

6、鄰苯二甲酸二丙酯、3種檢測鄰苯二甲酸二丁酯、2種檢測鄰苯二甲酸二環(huán)己酯等9種免疫分析檢測鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的新方法。建立的免疫分析方法均具有靈敏度高、選擇性好、簡單、快速等優(yōu)點。應用于實際樣品的測定，結(jié)果滿意。具體內(nèi)容如下：
　　 ①建立了固相抗原競爭熒光免疫法中的順序飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)的方法。當鄰苯二甲酸二乙酯濃度范圍線性范圍為6.0～60μg/L時，回歸方程為：△F=24180.1-1144.9

7、logC(C為DEP的濃度，μg/L)，相關系數(shù)R2=0.997，方法檢測限為1.0μg/L。當鄰苯二甲酸二乙酯濃度范圍為60～100μg/L時，回歸方程為：△F=38801.6-9230.9logC(C為DEP的濃度，μg/L)，相關系數(shù)R2=0.998。鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在7％以下，應用于實際的自來水、上海市蘇州河水等水樣和一次性塑料袋溶出液中鄰苯二甲酸二乙酯的測定，回收率在89.8％～109.9％之間，相對標準偏

8、差小于12％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ②建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的平衡飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二乙酯的方法。鄰苯二甲酸二乙酯濃度在1.0～500μg/L時，回歸方程為△F=11024.9-693.3logC(C為DEP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2=0.996。方法檢測限為1.0μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在10％以下，應用于實際的自來水、上海市蘇州河水等水樣和一次性塑料袋溶出液中鄰苯二甲酸二

9、乙酯的測定，回收率在90.2％～109.1％之間，相對標準偏差小于14％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ③建立了固相抗原競爭熒光免疫法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)的方法。鄰苯二甲酸二甲酯濃度在0.1～300μg/L時，回歸方程為△F=10381.3-658.9logC(C為DMP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2＝0.998。方法檢測限為0.1μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在10％以下，應用于上海市蘇州河

10、水、自來水等水樣和飲料瓶等溶出液中鄰苯二甲酸二甲酯的測定，回收率在92.4％～108.2％之間，相對標準偏差小于13％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ④建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的平衡飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)的方法。鄰苯二甲酸二丙酯濃度在1.0～200μg/L時，回歸方程為△F=6283.9-976.8logC(C為DPrP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2=0.996，方法檢測限為1.0μg/L，鄰苯二

11、甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在9％以下，應用于上海市蘇州河水、自來水等水樣和飲料瓶溶出液中的鄰苯二甲酸二丙酯的測定，回收率在91.8％～109.4％之間，相對標準偏差小于13％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ⑤建立了固相抗原競爭熒光免疫法中的平衡飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法。鄰苯二甲酸二丁酯濃度在0.1～100μg/L時，回歸方程為△F=4881.7-193.0logC(C為DBP的濃度，μg/L)，線性相關

12、系數(shù)R2=0.998。方法檢測限為0.05μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在9％以下，應用于自來水、上海市蘇州河水、塑料瓶裝水等水樣和飲料瓶溶出液中鄰苯二甲酸二丁酯的測定，回收率在90.5％～107.5％之間，相對標準偏差小于13％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ⑥建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的平衡飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丁酯的方法。鄰苯二甲酸二丁酯濃度在0.5～400μg/L時，回歸方程為△F=6548.1-

13、547.1logC(C為DBP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2=0.997。方法檢測限為0.3μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在9％以下，應用于自來水、上海市蘇州河水、塑料瓶裝水等水樣和飲料瓶溶出液中鄰苯二甲酸二丁酯的測定，回收率在90.1％～106.7％之間，相對標準偏差小于13％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ⑦建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的順序飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二丁酯的方法。鄰苯二甲酸二丁酯濃度在

14、0.1～30μg/L時，回歸方程為△F＝6206.5-744.7logC(C為DBP的濃度，μg/L，線性相關系數(shù)R2=0.995。方法檢測限為0.02μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在10％以下，應用于自來水、上海市蘇州河水、塑料瓶裝水等水樣和飲料瓶溶出液中鄰苯二甲酸二丁酯的測定，回收率在90.7％～108.8％之間，相對標準偏差小于13％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ⑧建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的順序飽和法測

15、定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)的方法。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯濃度在0.01～100μg/L時，回歸方程為△F=4127.2-550.2logC(C為DCHP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2=0.998，方法檢測限0.01μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都在7％以下，應用于自來水、上海市蘇州河水、塑料瓶裝水等水樣和飲料瓶溶出液中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的測定，回收率在90.6％～109.5％之間，測定的相對標準偏差小于11

16、％，樣品測定結(jié)果滿意。
　　 ⑨建立了固相抗體競爭熒光免疫法中的平衡飽和法測定環(huán)境激素鄰苯二甲酸二環(huán)己酯的方法。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯濃度在0.01～100μg/L時，回歸方程為△F＝3846.1-422.3logC(C為DCHP的濃度，μg/L)，線性相關系數(shù)R2=0.997，方法檢測限0.01μg/L，鄰苯二甲酸酯類環(huán)境激素的交叉反應率都12％以下，應用于自來水、上海市蘇州河水、塑料瓶裝水等水樣和飲料瓶溶出液中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯