結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白tb10.4hsp16.3納米金生物傳感器診斷結(jié)核病的研究

1、分類號(hào)學(xué)校代碼 ! Q 5 壘2密級(jí)學(xué)號(hào)2 Q 1 3 Q 2 2 Q 1 5 1 壘結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白T B 1 0 ．4 一H s p 1 6 ．3納米金生物傳感器診斷結(jié)核病的研究D i a g n o s i s o f t u b e r c u l o s i sw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s b i o s e n s o r b a s e d o n t h er e

2、 c o m b i n a n t f u s i o n p r o t e i nT B 1 0 ．4 一H s p 1 6 ．3o fM y c o b a c t e r i a t u b e r c u l o s i s指導(dǎo)教師姓名、職稱 盔垡薹塾撞湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二零一六年五月 一苓一六年直月摘 要目的：克隆并表達(dá)結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，分析其診斷結(jié)核

3、病的價(jià)值；并建立基于重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 診斷結(jié)核病的納米金生物傳感器，為結(jié)核病的血清學(xué)診斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。方法：( 1 ) 根據(jù)G e n B a n k 中結(jié)核分枝桿菌T B l 0 ．4 、H s p l 6 ．3 的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，以結(jié)核分枝桿菌H 3 7 R v 基因組D N A 為模版，聚合酶鏈反應(yīng)( P C R ) 擴(kuò)增T B l 0 ．4 和H s p l 6

4、．3 的基因片段，重疊延伸P C R 技術(shù)擴(kuò)增融合基因T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，克隆至p M D l 8 - T 載體，菌落P C R 和測序鑒定，將序列正確的融合基因T B l 0 ．4 一H s p l 6 ．3亞克隆至表達(dá)載體p E T 2 8 a ( + ) ，P C R 和雙酶切鑒定陽性重組子。( 2 )將重組D N A 轉(zhuǎn)化E ．c o l iB L 2 1 ，篩選陽性菌株，異丙基p ．D ．硫代半

5、乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，超聲裂解菌體，對(duì)包涵體進(jìn)行變性溶解和復(fù)性，H i s —b i n d T M 柱層析( N i 2 + - N T A ) 純化重組融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，W e s t e r nb l o t 分析其免疫學(xué)活性，E L I S A 評(píng)價(jià)其診斷結(jié)核病的價(jià)值。( 3 ) 晶種成長法制備金納米棒，經(jīng)M U A 、E D C 、N

6、 H S 化學(xué)修飾后，與融合蛋白T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 連接，構(gòu)建納米金生物傳感器，評(píng)價(jià)其對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。結(jié)果：( 1 ) 成功獲得約7 5 0 b p 的融合基因T B l 0 ．4 ．H s p l 6 ．3 ，構(gòu)建了融合蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒p E T - T B l 0 ．4 一H s p l 6 ．3 。( 2 ) 表達(dá)、純化獲得分子量約2 9 k D a 的融合蛋白T B 1 0 ．4 一H s p