結(jié)核分枝桿菌wbbl蛋白質(zhì)在e.coli中的可溶性表達(dá)和鑒定

1、大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)核分枝桿菌WbbL蛋白質(zhì)在E.coli中的可溶性表達(dá)和鑒定姓名：鄔強(qiáng)申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：馬郁芳20050601障。結(jié)核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株的基因組測序工作已完成。因此，H 3 7 R v 基因組數(shù)據(jù)庫為快速克隆目的基因提供了保障。編碼結(jié)核分枝桿菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的w b b L 基因?yàn)榛蚪M中的第3 2 6 5個(gè)開放閱讀框R v 3 2 6 5 。本論文的目的是：(

2、1 ) 利用P C R 方法從結(jié)核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株的基因組D N A 中擴(kuò)增出Y bw b b L 基因：( 2 ) 將T bw b b L 基因克隆到p M D l 8 - T 克隆載體中，經(jīng)D N A 序列測定證實(shí)為正確的基因；( 3 ) 將T bw b b L 基因亞克隆到p E T l 6 b 表達(dá)載體中并通過改變不同的誘導(dǎo)條件在大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中表達(dá)T bW b b L 蛋白質(zhì)；(

3、4 ) 建立在B L 2 l ( D E 3 ) 大腸桿菌中共表達(dá)T b W b b L 蛋白質(zhì)與分子伴侶的體系，優(yōu)化表達(dá)條件以高效表達(dá)出可溶性T bW b b L蛋白質(zhì)；( 5 ) 用W e s t e r nb l o t 方法鑒定所表達(dá)的T bW b b L 蛋白質(zhì)為T b w b b L 基因產(chǎn)物。本論文所獲得的結(jié)果如下：1 + 利用P C R 方法擴(kuò)增出正確的目的w b b L 基因從結(jié)核分枝桿菌H 3 7 R v 菌株基因組

4、數(shù)據(jù)庫f h t t p ：／／g e n o l i s t ．p a s t e u r ．f r ／T u b e r c u L i s t ／) 中獲得T bw b b L 基因的核瞢酸序列( 9 0 6b p ) 。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)一對P C R 引物，并在上游引物和下游引物的5 ’端分別引入了N d eI 和B a m H I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以便將w b b L 基因克隆到p E T l 6 b 表達(dá)載體的N d

5、e I 和B a m H I 位點(diǎn)。用具高保真性的L AT a qD N A 聚合酶，以H 3 7 R v菌株基因組D N A 為模板成功擴(kuò)增了w b b L 基因。2 ．p M D l 8 ．T b w b b L 的構(gòu)建及核苷酸序列測定將純化的P C R 產(chǎn)物與p M D l 8 ．T 載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌N o v a B l u e 菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。用限制性內(nèi)切酶酶切及P C R 方法鑒定出陽性重組質(zhì)粒p