強化融合蛋白fvldpae體外活性研究及產生融合蛋白fvldp的重組菌e.colibl21de3star39;tmpefl高密度發(fā)酵

1、中國協和醫(yī)科大學博士學位論文強化融合蛋白Fv-LDP-AE體外活性研究及產生融合蛋白Fv-LDP的重組菌E.coli BL21（DE3）Star/pEFL高密度發(fā)酵姓名：高瑞娟申請學位級別：博士專業(yè)：微生物與生化藥學指導教師：甄永蘇;李電東20060601中國協和醫(yī)科大學博士論文 中文摘要胞裂亡，其主要特征為：細胞體積增大，核增大、G 2 + M 期阻滯，細胞多核化等。H o e c h s t 3 3 3 4 2 和P I 雙染還可觀

2、察到一種與典型凋亡不同的染色質凝集方式：核膜基本保持完整，細胞貼壁，染色質散點狀凝集，形成多核，多核化細胞形態(tài)各異，發(fā)生頻率亦不相同。1n M F v —L D P —A E 致B E L 一7 4 0 2 細胞產生細胞裂亡的潛力較L D M 強，可使7 1 ％的細胞形成多核，而等濃度L D M 僅能使5 8 ．0 ％的細胞出現D N A 多倍性。對于同樣處理的P G 細胞，O ．1 n M 的兩種藥物均能使大于4 0％的細胞多核化，但

3、隨著藥物濃度的升高，多核化細胞比例逐漸下降。藥物致P A a細胞多核化比例較低，最高達3 4 ．8 ％，等濃度F v - L D P —A E 較L D M 促進細胞多核的效果好。這些結果說明，多核化頻率因細胞種類不同而異。除裂亡外，0 ．1 - 1n M F v ．L D P ．A E 和L D M 處理4 h ，繼續(xù)培養(yǎng)7 2 h 的P G 細胞和B E L 一7 4 0 2 細胞中還發(fā)生了細胞凋亡。大約2 0 ％或更少的P G 細

4、胞凋亡，但瓊脂糖凝膠電泳未檢測到D N A 梯帶，提示凋亡的l a G 細胞可能處于早期階段。流式分析表明，與對照組相比，F v - L D P - A E 和L D M 處理的B E L - 7 4 0 2 細胞產生了典型的凋亡亞G 1 峰，在0 ．1 ．1a M 范圍內，F v —L D P —A E 致細胞凋亡百分比高于等濃度L D M ，且均隨藥物濃度增大而降低，瓊脂糖凝膠電泳呈現典型D N A 梯帶。P A a 細胞中未發(fā)現典

5、型的凋亡現象。F v —L D P - A E 和L D M 還影響細胞周期進程。0 ．1 n M F v —L D P - A E 和L D M 分別使5 6 ．9 ％和6 0 ．7 ％的P G 細胞阻滯于G 2 + M 期，而0 ．5 n M 和1 n M 的F v —L D P - A E和L D M 則致P G 細胞阻滯于G 2 + M 期和s 期，其致s 期阻滯的最大百分比分別為6 9 ．1 ％和7 9 - 4 ％。在0 ．1

6、 —1n M 范圍內，F v —L D P —A E 和L D M 致P A a 細胞產生G 2 + M 期和s 期阻滯。本實驗濃度處理的B E L - 7 4 0 2 細胞由于細胞大量凋亡和裂亡的影響，處于周期中的細胞較少，失去周期分析的可行性。S A —B —g a l 染色分析顯示，F v ．L D P ．A E 和L D M 作用過的細胞出現衰老樣表型，且二者對同種細胞的S A —B —g a l 染色陽性率相仿，說明其作用在腫