重組高密度脂蛋白-阿霉素復(fù)合物用于腫瘤治療的研究.pdf

1、本研究旨在探討將重組高密度脂蛋白(rHDL)應(yīng)用于化療藥物向腫瘤遞送及克服腫瘤耐藥的可能性，并探討細(xì)胞自噬在腫瘤耐藥中的作用。使用硫酸銨梯度法制備重組高密度脂蛋白-阿霉素復(fù)合物(rHDL/Dox)，用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察肝癌細(xì)胞對(duì)rHDL/Dox的攝取，用MTT，western blot等方法評(píng)價(jià)rHDL/Dox對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷，用小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)來探討rHDL在小鼠體內(nèi)的肝靶向性。用real time PCR、流式分析和IC

2、50測(cè)定等方法證明KBV細(xì)胞的耐藥性，用MTT、western blot、細(xì)胞凋亡檢測(cè)以及Tunel染色等方法觀察rHDL/Dox克服腫瘤耐藥的效果。第三部分用western blot、Cyto-ID染色、EGFP-LC3轉(zhuǎn)染和電鏡觀察的方法證明rHDL/Dox誘導(dǎo)KBV細(xì)胞細(xì)胞自噬的發(fā)生，通過聯(lián)用細(xì)胞自噬抑制劑和使用RNA干擾技術(shù)證明細(xì)胞自噬在腫瘤耐藥中的作用。rHDL/Dox具有均勻的粒徑分布（～63nm）及顯著的緩釋功能;共聚焦觀

3、察和流式分析表明，通過SR-B1受體的介導(dǎo)作用rHDL/Dox可以在肝癌細(xì)胞內(nèi)積聚能多的阿霉素藥物;Western blot和LDH活性測(cè)定表明rHDL/Dox引起HepG2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞更強(qiáng)的caspase-3依賴性的凋亡和乳酸脫氫酶LDH的釋放(930U/L，836U/L);活體成像觀察表明rHDL在小鼠體內(nèi)具有較好的肝靶向性。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耐阿霉素細(xì)胞株KBV可較高水平表達(dá)SR-B1受體;與游離

4、阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素相比，rHDL/Dox可更好的克服P-糖蛋白(P-gp)對(duì)阿霉素的外排作用，在細(xì)胞內(nèi)積聚更多的阿霉素藥物，引起更強(qiáng)烈的caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡，和核內(nèi)DNA的斷裂。本研究還進(jìn)一步表明在rHDL/Dox處理KBV細(xì)胞時(shí)伴隨著細(xì)胞自噬的發(fā)生，細(xì)胞自噬增強(qiáng)了KBV細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐受和抵抗;聯(lián)用細(xì)胞自噬抑制劑氯喹和LY294002后，rHDL/Dox可更好地逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，引起更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡;基因敲除自噬相關(guān)基因Atg