分子生物學(xué)大實驗——目的基因的克隆及表達(dá)

1、1分子生物學(xué)大實驗分子生物學(xué)大實驗——目的基因的克隆及表達(dá)目的基因的克隆及表達(dá)第一節(jié)基因操作概述..............................................................................................................2一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)...............................................

2、..............................................2二、質(zhì)粒概述....................................................................................................................4三、凝膠電泳............................................

3、........................................................................5四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化........................................................................6五、重組質(zhì)粒的連接................................................

4、........................................................7六、限制性內(nèi)切酶消化....................................................................................................7七、SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳......................................

5、.....................................................7第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑......................................................................................................7一、材料................................................

6、............................................................................8二、設(shè)備............................................................................................................................8三、試劑：.........

7、...............................................................................................................9第三節(jié)操作步驟.....................................................................................................

8、...............10一、目的基因的獲得：..................................................................................................10二、pET21bT（pET21bR、pET21b）載體的獲得：..............................................11三、pET21b等與目的片段

9、的連接作用......................................................................12四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行陽性克隆子篩選與鑒定.............................................13五、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21plyst，搖菌進(jìn)行SDSPAGE電泳。.............................14六、融合蛋白的

10、毒力測定..............................................................................................16第四節(jié)本實驗的實驗報告....................................................................................................1634、模板：P

11、CR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102～105個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。擴(kuò)增多拷貝序列時，用量更少。靈敏的PCR可從一個細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個孢子或一個精子提取的DN

12、A中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。5、TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmolLdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般

13、PCR中出錯率為2104核苷酸每輪循環(huán)。在100μlPCR反應(yīng)中，1.5～2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。6、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10～50mmolLTrisCl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmolLKCl和適當(dāng)濃度的Mg2。TrisCl在20℃時pH為8.3～8.8，但在實際PCR反應(yīng)中，pH為6

14、.8～7.8。50mmolL的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmolL的二硫蘇糖醇(DDT)或100μgml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性。（二）、PCR反應(yīng)參數(shù)1、變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，

15、因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時間為94℃1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高