浙江大學(xué)管敏鑫教授x

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,管敏鑫,,,線粒體功能缺陷和人類疾病,線粒體,直徑范圍從0.5到10微米（μm）。能產(chǎn)生供應(yīng)細(xì)胞作為化學(xué)能量的絕大多數(shù)三磷酸腺苷（ATP），因此，有細(xì)胞“動(dòng)力工廠”參與了一系列其他細(xì)胞功能，如信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡。是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基的主要場(chǎng)所。,Mitochondria make a comeback,線粒體疾病,母系遺傳性疾?。ㄈ缒赶颠z傳性耳聾、Leber遺傳性視神經(jīng)萎縮和其他神經(jīng)肌肉疾病等）復(fù)

2、雜性疾?。ㄈ绨┌Y、帕金森病、糖尿病、高血壓等）,Mitochondrial Disorders,,人類線粒體蛋白 （1500）,mtDNA基因和組成線粒體氧化磷酸化復(fù)合體所需的13種多肽 ～1500多肽： 染色體中的核DNA編碼，這些基因編碼的線粒體蛋白在細(xì)胞質(zhì)核糖體中合成，通過(guò)線粒體蛋白轉(zhuǎn)入系統(tǒng)有選擇地運(yùn)輸?shù)骄€粒體,人類線粒體DNA的分子結(jié)構(gòu),16569 bp,環(huán)狀雙鏈DNA分子富含G的重鏈（H鏈，外環(huán)）富含C的輕鏈（L鏈）

3、基因之間沒(méi)有間隔，無(wú)內(nèi)含子序列 編碼37個(gè)基因，呼吸鏈復(fù)合體必需的13個(gè)多肽，22個(gè)tRNA基因2個(gè)編碼rRNA（12S rRNA、16S rRNA）,Specific features of mitochondrial genome,拷貝 Multiple copies: 1,00-100,000同質(zhì)性(Homoplasmy) or heteroplasmiy(異質(zhì)性)母系遺傳 （Maternally transmitte

4、d）遺傳瓶頸效應(yīng) bottle neck effects 密碼子系統(tǒng)特性 Specific genetic codons半自主復(fù)制 Replication independent of cell division cycle閾值效應(yīng) Threshold effects高突變率 High mutation rates:,A Chinese family with maternally transmitted aminoglyco

5、side-induced and nonsyndromic deafness (Zhao et al. AJHG. 2004),線粒體DNA的閾值效應(yīng),同質(zhì)性（homoplasmy）:在正常人的細(xì)胞中，所有的mtDNA都來(lái)源于母親的卵細(xì)胞，若每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的所有mtDNA都相同，全部突變或者全部正常。異質(zhì)性（heteroplasmy）。而在同一細(xì)胞里的mtDNA同時(shí)存在野生型mtDNA和突變型mtDNA，在異質(zhì)性細(xì)胞中，異質(zhì)性細(xì)胞的表現(xiàn)

6、型依賴于細(xì)胞內(nèi)突變型和野生型mtDNA的相對(duì)比例，能引起特定組織器官功能障礙的突變mtDNA的最少數(shù)量稱閾值。,線粒體DNA的遺傳瓶頸,卵母細(xì)胞中大約有10萬(wàn)個(gè)線粒體DNA，當(dāng)卵母細(xì)胞成熟后，線粒體的數(shù)目會(huì)減少，可能少于10個(gè)，但不會(huì)超過(guò)100個(gè)，這個(gè)過(guò)程被稱之為遺傳瓶頸效應(yīng)（genetic bottle neck effects）。,mtDNA基因突變,堿基突變插入缺失拷貝數(shù)變異,卡恩斯一塞爾綜合征 KSS syndrome,C

7、linical features: Progressive external ophthalmoplegia and degeneration of the pigment layer of retina;Molecular basis: heteroplasmic mitochondrial DNA deletion: 1/3 of cases are due to a 4,977-bp deletion (common dele

8、tion). Can be detected by Southern Blot analysis;Severity of phenotype depends on the level of mtDNA deletions,線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作 MERRF-syndrome,MERRF-associate-tRNALys-A8344G mutationVariable severity and age-on-set o

9、f phenotypesHeteroplasmic mutationtRNA metabolismProtein synthesisATP production,線粒體腦肌病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作（MELAS）,Heteroplasmic mutationVariable clinical phenotypeAlternation in tRNA metabolismProtein synthesisATP pr

10、oduction,Leber遺傳性視神經(jīng)病 (LHON),Maternally inherited disorder leading to the rapid, painless, bilateral loss of center vision A marked gender bias: male> femaleAge-on-set: 7-60 yearsA variable severity Three mtDNA mu

11、tations accounting for 90% cases of LHON,耳聾,,全球聽(tīng)力障礙人口約有2.8億 (WHO，http://www.who.int)我國(guó)有聽(tīng)力障礙人口2780萬(wàn)， 且每年新增3萬(wàn)多聾兒 (2006年第二次全國(guó)殘疾人口普查， http://www.cdpf.org.cn),耳聾是全球性重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,耳聾的致病因素,遺傳性耳聾及常見(jiàn)致聾基因,浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,20,在耳聾患者人群中，50

12、%以上是由遺傳因素造成的。目前，發(fā)現(xiàn)的與耳聾相關(guān)的基因達(dá)百余個(gè)。中國(guó)耳聾人群中最常見(jiàn)的基因突變主要分布在GJB2基因（20%）、SLC26A4基因及線粒體基因組等 .GJB2基因突變熱點(diǎn)存在著種族差異。中國(guó)耳聾人群中常見(jiàn)的突變包括 235delC、299delAT、176del16bp等。,浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,21,藥物性耳聾是新生兒先天性耳聾及成人后天性耳聾的主要原因。我國(guó)近三千萬(wàn)的聽(tīng)力障礙患者中，約20%-30%有氨基糖甙類抗

13、生素藥物接觸史。氨基糖甙類抗生素在臨床上主要用于治療革蘭氏陰性桿菌等細(xì)菌引起的感染，包括慶大霉素、小兒利寶、奈替米星、鏈霉素、丁胺卡那霉素等。 2%-5%的聽(tīng)力正常人接觸氨基糖甙類抗生素后會(huì)出現(xiàn)不可逆的聽(tīng)力損失(劑量效應(yīng)）。但有些個(gè)體少劑量、短時(shí)程應(yīng)用此類抗生素后也會(huì)發(fā)生耳聾，即臨床上常見(jiàn)的“一針致聾”現(xiàn)象（遺傳因素） 。,氨基糖甙類藥物性耳聾,發(fā)現(xiàn)了氨基糖甙類藥物性耳聾母系遺傳的規(guī)律,,1984年開(kāi)始對(duì)江蘇省淮陰縣一個(gè)藥物性耳聾大

14、家系（6代507人）進(jìn)行系統(tǒng)研究，在國(guó)際上首次報(bào)道氨基糖甙類藥物性耳聾的母系遺傳的現(xiàn)象（母系后代用藥發(fā)病而父系后代用藥不發(fā)?。?。而后，我們相繼發(fā)現(xiàn)了近300個(gè)藥物性耳聾家系具有相同的遺傳規(guī)律。,Maternally transmitted hearing loss families carrying mitochondrial 12S mutations,,Guan et al., 2006, AJHG 79:291-302.,Zha

15、o et al., 2006, AJHG 74:139-152.,母系遺傳藥物性耳聾的分子致病機(jī)制,浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,24,在家族性的藥物損傷性耳聾中，對(duì)氨基糖甙類抗生素的高度敏感性通常表現(xiàn)為母系遺傳，提示線粒體基因組突變可能是這種遺傳易感性的分子基礎(chǔ) 。線粒體基因組A1555G突變和C1494T突變是引起氨基糖甙類抗生素耳毒性聾的原因之一。,基因檢測(cè)報(bào)告單-A1555G突變,,浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,25,降低耳聾發(fā)生率,基因診斷

16、,浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,26,,Mutations in Mitochondrial Genome Associated with Human Diseases,RearrangementsDeletionsDuplicationsPoint mutations>150 pathogenic mutationstRNArRNAprotein encoding genes,,,總 體 思 路,,線粒體12S rRNA

17、A1555G和C1494T 是引起藥物性耳聾的主要易感突變,,藥 敏 實(shí) 驗(yàn),Function characterization,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Cybrids cell system used for the functional assays,DonorLymphoblast cells (TK+, Ur+),Recipient: ro Cell(mtDN

18、A-less 206 cell ) (TK-, Ur- ),,,,,,,,,,,,,,,,,Enucleation,MixFusion,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Trans-mt Hybrid donor

19、 ρ0 Cell ( TK-, Ur+ ) (TK+, Ur+) (TK+, Ur+) (TK-, Ur- ),Cybrids ( TK-, Ur+ ),+Brdu-Uridine,cytoplasts,,,,,,PEG,Eletrophoretic Patter

20、ns of Mitochondrial Translation Products,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,20,40,60,80,100,A,v,e,r,a,g,e,,p,e,r,c,e,n,t,,r,e,l,a,t,e,d,,t,o,,c,o,n,t,r,o,l,AS,S,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,20,40,60,80,100,AS,S,Relative rate of the mitocho

21、ndrial protein synthesis in cells carrying the A1555G mutation,Lymphoblastoid cells(Guan et al. HMG 1996),Cybrids cells(Guan et al. 2001),A,v,e,r,a,g,e,,p,e,r,c,e,n,t,,r,e,l,a,t,e,d,,t,o,,c,o,n,t,r,o,l,Proposed Pathoge

22、nic Mechanism of Deafness-Associated 12S rRNA A1555G or C1494 mutation,?,?,?,核修飾基因增強(qiáng)了A1555G突變相關(guān) 的耳聾表型表達(dá),Trmu/Mto2, Mto1, and Mss1/Gtpbp3 are the modifying enzymes for the modification of U34 at tRNALys, tRN

23、AGlu and tRNAGln,,,Yeast mto2 null mutants expresses a respiratory deficient phenotype only when combined with the 15S rRNA C1409G mutation,Wild type mtDNA,mtDNA C1409G mutation,,,Yan et al. JBC (2005);,mto2 mutant exhib

24、its defect in 2-thio modifications of the mt tRNAGln, tRNALys, and tRNAGlu, but not cytoplasmic tRNALys (Umeda et al. JBC, 2005),,APM,TRMU (MTO2) is the nuclear modifier gene for the phenotypic expression of deafness-

25、associated 12S rRNA mutations,Mutational screening of TRMU in 243 European, Israeli and Chinese deafness pedigrees identified the A10S mutation in TRMU gene.We performed the functional characterization of the mutation.,

26、,8 European/Israeli deafness pedigrees with the A1555G mutations,,A10S mutation located at the N-terminal region of TRMU,,The A10S mutation did not affect importing into mitochondria and processing of Trmu processor,TRM

27、U A10S mutation altered mitochondrial tRNA metabolism,Defects in tRNA modification,tRNA North blot,,,,Mitochondrial protein labeling analysis,,,,Proposed Pathogenic Mechanism of Deafness-Associated 12S rRNA A1555G or C14

28、94 mutation,,,,,浙江省范圍內(nèi)收集1642例聾兒樣本，其中461例有氨基糖甙類藥物史。另收集450例正常對(duì)照，對(duì)12S rRNA基因進(jìn)行序列分析。A1555G和C1494T突變攜帶者占總耳聾患者的5%（82/1642），約占藥物性耳聾患者的15% （69/461）。另外，我們還發(fā)現(xiàn)了其他66個(gè)變異位點(diǎn)，并進(jìn)行了突變?cè)u(píng)估。,浙江省聾病人群12S rRNA基因的分子流行病學(xué),線粒體DNA繼發(fā)突變和單體型可增強(qiáng) A15

29、55G突變的耳聾表型的表達(dá),攜帶A1555G突變的耳聾家系內(nèi)和家系間母系成員的耳聾外顯率、發(fā)病年齡和聽(tīng)力損失程度存在很大差異，提示線粒體遺傳背景（單體型和繼發(fā)突變）影響A1555G突變相關(guān)的耳聾表型表達(dá),單體型是相似單倍體的集合，來(lái)自同一祖先并具有相同核苷酸突變位點(diǎn)本項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)浙江省69例攜帶A1555G突變耳聾家系分別屬于10種東亞人群?jiǎn)误w型,線粒體單體型可增強(qiáng)A1555G突變相關(guān)的耳聾表型的表達(dá),,繼發(fā)突變是指與A1555G突變存

30、在協(xié)同作用，增強(qiáng)表型表達(dá)的線粒體基因其他位點(diǎn)的突變。進(jìn)化上保守有結(jié)構(gòu)改變有功能意義本身不足以造成耳聾,線粒體基因繼發(fā)突變可增強(qiáng)A1555G突變相關(guān)的耳聾表型表達(dá),浙江省人群耳聾家系中單體型D為主要單體型線粒體單體型B和C能增強(qiáng)線粒體A1555G突變相關(guān)耳聾的外顯率,69例攜帶A1555G突變耳聾家系單體型分析,線粒體DNA繼發(fā)突變加重耳聾原發(fā)突變位點(diǎn)A1555G 的致病性。,9個(gè)線粒體DNA繼發(fā)突變,母系遺傳藥物性耳聾的分子

31、致病機(jī)制,提出了中國(guó)人群藥物性耳聾的干預(yù)策略,在高危人群和易感人群中開(kāi)展線粒體基因突變篩查，并建立基因檔案，是減少母系遺傳藥物性耳聾發(fā)生率的有效措施,基因篩查可預(yù)防藥物性耳聾的發(fā)生,已使 4000 名未發(fā)病的母系成員（包括孕期母親和新生兒）直接受益，并使這些家系中新生代先天性聾啞及語(yǔ)前聾發(fā)生率接近于零。根據(jù)本研究調(diào)查結(jié)果，平均每發(fā)現(xiàn)1個(gè)攜帶線粒體A1555G或C1494T突變的耳聾患者，就可以避免其家庭內(nèi)平均10個(gè)未發(fā)病的母系成員因

32、使用氨基糖甙類抗生素而出現(xiàn)耳聾。此項(xiàng)成果若在全國(guó)范圍內(nèi)推廣，預(yù)計(jì)可使我國(guó)1390萬(wàn)人（139萬(wàn)×10）受益。,社 會(huì) 效 益,Cincinnati Children’s Hospital California Institute of TechnologyMedical CenterGiuseppe Attardi, M.D. Min-Xin Guan, Ph.D. Cedar-Sinai Medical

33、Center, UCLA Nathan Fischel-Ghodsian, Ph.D. Qingfang Yan Tel Aviv University, Israel Xiaoming Li Mordechai ShohatHui Zhao University of TokyoRonghua Li Tom Suzuki Jennifer

34、Petes Insitut Curie, Paris, FranceLi Yang Gerard Faye, William Gibbon, Jr. Hospital Ramon y Cajal, Madrid, Spain Yaping Qian Ignacio del Castillo Laura Johnson Chinese PLA General Hospital, China

35、Selena Heman-Ackah Weiyen YangXinjiang Wang Wenzhou Medical College, China Jia Qu, Jianxin Lu, Ziyuan Li, These works have been supported byNIH grants DC04958, DC04530, DC07696 and NS44015Deafness Re