膿毒癥發(fā)病機(jī)制講課幻燈片

1、膿毒癥病理生理基礎(chǔ)及其研究進(jìn)展,解放軍總醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第一附屬醫(yī)院全軍燒傷研究所,姚 詠 明,,,國家973項目和國家杰出青年基金資助,,,研 究 背 景,膿毒癥(Sepsis)是嚴(yán)重創(chuàng)(燒、戰(zhàn))傷、休克、感染、外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征 (MODS)，是臨床危重患者的最主要死亡原因之一。膿毒癥和MODS來勢兇猛、病情進(jìn)展迅速、預(yù)后險惡，給臨床救治工作帶來極大困難，已成為現(xiàn)代危重

2、病醫(yī)學(xué)面臨的突出難題。,,Sands KE et al. JAMA. 1997; 278: 234-40; ? Based on data for septicemia. Murphy SL. National Vital Statistics Reports. Angus DC et al. Crit Care Med. 2001 Reflects hospital-wide cases of severe sepsi

3、s as defined by infection in the presence of organ failure.,膿毒癥 新世紀(jì)對人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大挑戰(zhàn),全球性的威脅和挑戰(zhàn)，患病率約為人口的 3/1000，全球總病例數(shù)約1800萬/年，相當(dāng)于丹麥、芬蘭、愛爾蘭和挪威人口的總和；美國患病人數(shù)為75萬/年；歐洲為13.5萬/年。 全世界死亡人數(shù)超過1.4萬/天；美國21.5萬/年，并成為美國非心臟 ICU 死亡的主因。尚有

4、相當(dāng)?shù)乃劳霾±龥]有計算在內(nèi)，而歸咎于原發(fā)病。在美國平均治療費用約$2.2萬/例，年耗資近$200億；歐洲年耗資近$100億；截至1995年，總研發(fā)費用已經(jīng)超過$10億。發(fā)病人數(shù)正以年1.5％的比例增長；過去10年間，增加病例139%，且有繼續(xù)增加的趨勢。,,膿毒癥與其他嚴(yán)重病癥的比較,,,,?National Center for Health Statistics, 2001. §American Cancer Soci

5、ety, 2001. *American Heart Association. 2000. ?Angus DC et al. Crit Care Med. 2001.,AIDS*,Colon,Breast,Cancer§,CHF?,Severe Sepsis?,Cases/100,000,,膿毒癥的發(fā)生率,膿毒癥的病死率,AIDS*,SevereSepsis?,AMI?,Breast Cancer§,17,50,1

6、10,130,300,211000,215000,膿毒癥與急性心梗死亡率變化的比較,,,,,,,,,,,,1960年 1995年,10%,20%,30%,40%,50%,膿毒癥,急性心梗,,2002年巴塞羅那宣言,,,全社會要像當(dāng)年重視“中風(fēng)”和“急性心?！币粯樱匾晫δ摱景Y的研究和治療，爭取把膿毒癥的發(fā)生率和死亡率降低到可接受的水平。,,,研 究

7、背 景,盡管膿毒癥新概念與臨床特征的認(rèn)識有所進(jìn)步，但膿毒癥、MODS的臨床試驗性治療相繼失敗，其病死率仍居高不下(50~80%)。究其原因，關(guān)鍵是有關(guān)膿毒癥和MODS的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機(jī)制尚未充分闡明，缺乏早期有效的預(yù)防與治療措施。因此，開展其研究具有極其重要的理論意義和實用價值。,,,膿毒癥基礎(chǔ)研究進(jìn)展,遺傳背景 (基因多態(tài)性研究) 重要誘發(fā)因素 (微生物及其產(chǎn)物、內(nèi)/外毒素作用)晚期炎性介質(zhì)與效應(yīng)分子 (高遷移率族蛋白-1、B

8、H4)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 (MAPK通路, JAK/STAT通路)網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)與器官間相互作用 (神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫 凝血-纖溶-炎癥)基因組學(xué)與蛋白組學(xué)調(diào)節(jié)方法與干預(yù)途徑 (活化蛋白C),,,,,,,,,嚴(yán)重?fù)p傷后全身性炎癥反應(yīng)失控及器官損害受體內(nèi)眾多基因的調(diào)控，但為何有的人群易于并發(fā)膿毒癥

9、和MODS？對MODS患者采取相似的治療方案，但機(jī)體反應(yīng)和預(yù)后可能完全不同。這些現(xiàn)象是否與體內(nèi)存在某種MODS相關(guān)的“易感基因”或基因表達(dá)特性的改變影響宿主對應(yīng)激狀態(tài)的敏感有關(guān)？,,,,基因多態(tài)性,TNF-?2 純合子患者 TNF-?水平和病死率均高于雜合子或TNF-?1 純合子患者，證實TNF-?2基因型可能是嚴(yán)重膿毒癥患者出現(xiàn)高TNF-?水平和不良預(yù)后的基因標(biāo)志之一。TNF-?雙等位基因Nco1多態(tài)性與嚴(yán)重膿毒癥和器官損害的發(fā)生

10、密切相關(guān), 分析其多態(tài)性有助于評估并發(fā)膿毒癥和MODS的易感性及明確對抗TNF免疫治療的反應(yīng)性。,,,基因多態(tài)性 (基因組序列上的變異) 是決定人體對應(yīng)激打擊易感性與耐受性、臨床表型多樣性及藥物治療反應(yīng)差異性的重要因素。,,基因多態(tài)性,,,? 基因大規(guī)模直接測序，明確了中國人群中一些在創(chuàng)、燒傷感染發(fā)病中起關(guān)鍵作用的效應(yīng)分子的基因多態(tài)性分布，并初步進(jìn)行了臨床關(guān)聯(lián)分析和功能研究。? 已明確 TLR4受體 5’ 區(qū)-1892G→

11、A、-1837 A→G、 CD14 啟動子區(qū) -1145G/A 和 -159C/T、IL-1β啟動子區(qū)-1470 G→C 、-511T→C和 -31 C→T與創(chuàng)傷感染易感性存在密切的內(nèi)在聯(lián)系。,12,,CD14 C-159T基因多態(tài)性對 TNF-α mRNA表達(dá)的影響,13,,,CD14 C-159T基因多態(tài)性對LBP濃度的影響,攜帶不同CD14基因多態(tài)性燒傷患者單核細(xì)胞表面HLA-DR的表達(dá),*,,*,*,燒傷膿毒癥患者預(yù)后與單核細(xì)

12、胞HLA-DR結(jié)合量的關(guān)系,**,**,**,**,*,16,,CD14 C-159T基因多態(tài)性與 MODS發(fā)生率及死亡率的關(guān)系,,71例特重度燒傷患者基因型與膿毒癥及死亡率的關(guān)系,18,,,臨床試驗性治療膿毒癥的實踐中，應(yīng)當(dāng)考慮基因的因素。如果對照和治療組CD14C-159T或其他易感基因多態(tài)性的分布頻率不一致，那么結(jié)果無論是支持或是否定試驗性治療，其判定很可能會產(chǎn)生偏差。 膿毒癥早期識別與判定預(yù)后的輔助工具。在不久

13、的將來，基因多態(tài)性的檢測很可能會幫助患者選擇個體化的有針對性的治療 ，從而有利于降低膿毒癥 和/ 或MODS 的發(fā)病率。,,,,,細(xì)菌內(nèi)毒素,內(nèi)毒素血癥與細(xì)菌感染關(guān)系密切, 是創(chuàng)傷感染的重要致病因素之一。創(chuàng)傷膿毒癥中, 內(nèi)毒素常常與細(xì)菌協(xié)同致病, 兩者同時并存。內(nèi)毒素具有極廣泛而又復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，膿毒癥、MODS病理過程中出現(xiàn)的失控炎癥反應(yīng)、免疫機(jī)能紊亂、高代謝狀態(tài)及多臟器功能損害均可由內(nèi)毒素直接或間接觸發(fā)。,G- 菌細(xì)胞壁最外層

14、結(jié)構(gòu), 主要成分為脂多糖 (LPS) 。由三部分組成： 外層為O-特異性多糖鏈, 為細(xì)菌特異性抗原; 中層為R-核心多糖, 為細(xì)菌類屬共同的抗原; 內(nèi)層為類脂A, 主要決定其生物活 性。,分子結(jié)構(gòu)特征,,,,,1. 刺激單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、粒細(xì)胞合成、釋放介質(zhì)、蛋白酶類物質(zhì)等，介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)組織、細(xì)胞的損傷; 2. 促進(jìn)血小板凝集，激活凝血、纖溶系統(tǒng)，從而觸發(fā)DIC;,生物學(xué)活性,生物學(xué)活

15、性,3. 對免疫系統(tǒng)的影響, 可激活補(bǔ)體、促進(jìn)Ｂ淋巴細(xì)胞有絲分裂、誘導(dǎo)干擾素, 并有抗腫瘤及免疫佐劑作用; 4. 引起病理生理改變: 發(fā)熱反應(yīng)、血壓降低、代謝改變、局部過敏反應(yīng)。,1. 全身網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙, 免疫機(jī)能下降, 腸道吸收的內(nèi)毒素過多超過機(jī)體之清除能力;2. 胃腸道粘膜缺血、壞死, 屏障功能破壞, 通透性增高, 大量內(nèi)毒素釋放入血;,內(nèi)毒素血癥發(fā)生原因,3. 腸道來源的內(nèi)毒素因肝功能障礙由

16、側(cè)支循環(huán)直接入體循環(huán); 4. 某些組織、器官G- 菌感染病灶持續(xù)產(chǎn)生的內(nèi)毒素吸收入血。,內(nèi)毒素血癥發(fā)生原因,燒傷早期即出現(xiàn)內(nèi)毒素水平升高, 傷后 3 ~ 4天達(dá)高峰, 2 ~ 3周又出現(xiàn)回升。 內(nèi)毒素水平隨燒傷面積的增加而增加。 內(nèi)毒素血癥發(fā)生率達(dá) 36.8 ~ 74.7%, 而 菌血癥陽性率僅3.0 ~ 38.2%。,發(fā)病過程及規(guī)律,,既往多認(rèn)為來源于創(chuàng)面或血循環(huán)G

17、- 菌 感染后大量釋放。 早期主要不是源于創(chuàng)面 , 腸道蓄積內(nèi) 毒素侵入血循環(huán)可能是最重要的來源。 后期內(nèi)毒素水平的再度升高，與難以 控制的創(chuàng)面膿毒癥相關(guān)。,燒傷后內(nèi)毒素血癥來源,,與感染、免疫的關(guān)系 與膿毒癥、多臟器功能障礙綜合 征的關(guān)系 循環(huán)內(nèi)毒素含量監(jiān)測的臨床價值,內(nèi)毒素血癥的臨床意義,,內(nèi)毒素血癥與細(xì)菌感染關(guān)系

18、密切, 是創(chuàng)傷感染中的重要致病因素之一。在燒傷膿毒癥中, 內(nèi)毒素常常與細(xì)菌協(xié)同致病, 兩者同時并存。但有時血液內(nèi)毒素檢測呈陽性反應(yīng), 而細(xì)菌培養(yǎng)不一定陽性, 提示內(nèi)毒素血癥可單獨存在。,不同燒傷面積內(nèi)毒素血癥及菌血癥陽性率比較,燒傷面積 內(nèi)毒素血癥 菌血癥,組別,(％) 例數(shù) ％ 例數(shù) ％,,,,,III.

19、30-49 21/57 36.8 1/33 3.0 II 50-69 23/44 52.3 2/21 9.5III 70-98 65/87 74.7 18/47 38.2*#,,燒傷后內(nèi)毒素血癥出現(xiàn)時間早于菌血癥, 內(nèi)毒素可促進(jìn)細(xì)菌移位。內(nèi)毒素血癥與嚴(yán)重創(chuàng)傷后全身播散性感染的發(fā)生

20、亦緊密相關(guān)。內(nèi)毒素血癥與膿毒癥相關(guān)率達(dá)70%, 當(dāng)內(nèi)毒素持續(xù)升高時, 應(yīng)警惕播散性細(xì)菌感染的發(fā)生。,細(xì)胞免疫異常表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞對促有絲分裂因子刺激反應(yīng)降低, 伴Ts增多、Th減少。細(xì)胞免疫障礙與血清中過量內(nèi)毒素有關(guān)。 多粘菌素B可部分恢復(fù)NK細(xì)胞活性及逆轉(zhuǎn)Th/Ts異常, 且能消除燒傷血清對IL-2抑制反應(yīng)。,內(nèi)毒素在燒傷后免疫抑制中的作用,,休克初期發(fā)生內(nèi)毒素血癥，Re-LPS抗血清輸注后血漿 PGE2明顯降低。燙

21、傷后脾細(xì)胞對 Con A或PHA刺激反應(yīng)及誘生 IL-2活性抑制。SDD可顯著降低內(nèi)毒素水平，同時脾細(xì)胞增殖應(yīng)答及誘生IL-2明顯升高。,腸源性內(nèi)毒素對全身免疫的影響,,,,脾細(xì)胞對Con A刺激增值反應(yīng)的改變,**,*,脾細(xì)胞 IL-2 活性的改變,*,*,1. 通過PGE2對免疫系統(tǒng)下向調(diào)控引起多方面抑制效應(yīng);2. 導(dǎo)致單核細(xì)胞提呈抗原表達(dá)能力降低, 并抑制中性粒細(xì)胞趨化性受體的表達(dá); 3. 激活單核巨噬細(xì)胞誘生細(xì)胞因

22、子, 介導(dǎo)對機(jī)體防御機(jī)能及多器官損害效應(yīng);4. 經(jīng)替代途徑活化補(bǔ)體, 生成補(bǔ)體裂解產(chǎn)物。,內(nèi)毒素介導(dǎo)燒傷免疫抑制的機(jī)制,,MODS家兔內(nèi)毒素含量升高幅度大、持續(xù)較高水平，且與多器官功能相關(guān)顯著。輸注 Re-LPS 抗血清后，內(nèi)毒素升高幅度及持續(xù)時間顯著降低，MODS發(fā)生率休克早期給予rBPI21可完全中和循環(huán)內(nèi)毒素，能減輕肝、肺、腎及腸道損害等。,內(nèi)毒素與膿毒癥、MODS的關(guān)系,,,,,,MODS與非MODS患者內(nèi)毒素水平

23、比較,**,*,**,**,血漿內(nèi)毒素水平與MSOF發(fā)生頻率,內(nèi)毒素 例數(shù),(EU/ml) MSOF NMSOF 死亡,,,,<0.20 18 0 18 0

24、 0.20~ 9 1 8 1 0.50~ 6 4 2 3 1.00~ 2 2 0

25、 2,,總例數(shù),A. 內(nèi)毒素血癥臨床表現(xiàn)與 G - 菌膿毒癥相似。 對燒傷內(nèi)毒素血癥診斷除體征外，主要依據(jù)血中內(nèi)毒素測定結(jié)果。B. LAL 具有快速、靈敏、不受抗生素治療影響等優(yōu)點而逐漸應(yīng)用于臨床。,循環(huán)內(nèi)毒素含量監(jiān)測的臨床價值,,,循環(huán)內(nèi)毒素含量監(jiān)測的臨床價值,C. 血漿內(nèi)毒素含量可以比較穩(wěn)定和敏感地反映機(jī)體G- 菌感染的動態(tài)變化過程。D. 連續(xù)動態(tài)觀察其變化，對燒傷后膿毒癥的早期診斷、病程監(jiān)測及預(yù)后評價可能有指導(dǎo)作用。,

26、,,外毒素研究背景,諸多研究證實，細(xì)菌、內(nèi)毒素、病毒及寄生蟲感染等在機(jī)體的膿毒性反應(yīng)中均可起觸發(fā)劑作用 , 其中革蘭陰性菌及其內(nèi)毒素在膿毒癥發(fā)病中的作用與機(jī)制已進(jìn)行了較為廣泛、深入的研究。然而，長期以來，人們對于革蘭陽性菌及其外毒素的致病意義認(rèn)識不足。,臨床資料表明, 革蘭陽性菌膿毒癥的發(fā)病率逐年上升，至二十世紀(jì)90年代末已達(dá)膿毒癥發(fā)病率的 50％以上，并仍有升高趨勢。其中金黃色葡萄球菌 (簡稱金葡菌)發(fā)病率位居首位，是燒傷創(chuàng)面感染、急

27、性肝功能衰竭的重要病原菌。,革蘭陽性菌感染率上升原因,,,大量抗生素治療主要是針對 G－菌，從而使得 G＋致病菌感染機(jī)會增多；長時間血管內(nèi)導(dǎo)管的應(yīng)用越來越多；手術(shù)移植物的廣泛應(yīng)用(人造關(guān)節(jié)、瓣膜、血管等)；G＋菌感染病原菌的變遷；抗生素耐藥性在G＋致病菌中的播散[如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA) ，耐青霉素肺炎鏈球菌，耐萬古霉素糞腸球菌]。,,,,,,,燒傷病區(qū)金葡菌流行情況,,,保加利亞資料證實， 無論是燒傷創(chuàng)面還是血

28、標(biāo)本中金葡菌檢出率均居首位 (31.4% 和 35.0%), 且MRSA耐藥率逐年增高。瑞金醫(yī)院從創(chuàng)面分離獲得菌株601株，金葡菌最多見(271株，45.1%)，MRSA耐藥率高達(dá)79.1%。長海醫(yī)院分析 95 例燒傷合并血源性感染時發(fā)現(xiàn) ，金葡菌占 29.2%，是導(dǎo)致膿毒癥的重要病原菌。,,,,,金 葡 菌 主 要 致 病 因 子,,,外毒素 (腸毒素、TSST-1、溶血素)酶 (血漿凝固酶、透明質(zhì)酸酶、溶脂酶)

29、細(xì)胞抗原 (莢膜抗原、細(xì)胞壁成分、A蛋白),,,,,細(xì)菌學(xué)研究表明 ， 可溶性外毒素的產(chǎn)生是G＋菌感染的重要標(biāo)志之一，在G＋菌感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。其中金葡菌腸毒素因其 “超抗原” 特性以及在中毒性休克綜合征發(fā)病中的特殊意義而倍受關(guān)注。,,,,,,,,,T 細(xì)胞,,抗原呈遞細(xì)胞,,T細(xì)胞抗原受體,,MHC II分子,,T 細(xì)胞,,,,抗原呈遞細(xì)胞,,,普通抗原,,超抗原,TCRV?區(qū),,,,ng/ml,,,金

30、葡菌及其外毒素的分布、產(chǎn)毒率與意義,創(chuàng)面分離病原菌1880株，金葡菌分離率從1995年的17.7% (第3位)上升為1999年的29.3%(居第1位)、2003年44.4%。 278例次靜脈內(nèi)置管的嚴(yán)重?zé)齻∪耍?例次發(fā)生導(dǎo)管膿毒癥(5例死亡)，其分離病原菌中金葡菌占50%以上。燒傷患者分離127株金葡菌產(chǎn)毒率達(dá)91.6%，以同時產(chǎn)生多種類型毒素者居多[同時產(chǎn)腸毒素B、C 者最為常見]，其中90%以上為耐藥菌株。檢測100株

31、金葡菌腸毒素產(chǎn)生情況，其中 60 株 MRSA全部產(chǎn)一種以上腸毒素，而40株非MRSA產(chǎn)毒率僅為20%。,,金葡菌感染檢測與診斷技術(shù),常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定方法 (時間較長、陽性率低)金葡菌產(chǎn)毒試驗 (體外產(chǎn)毒情況，耗時較長)血液金葡菌腸毒素水平分析技術(shù) (敏感、快速、方便),本實驗采用改良雙單抗夾心BA-ELISA方法，利用單克隆抗體的特異性和生物素-鏈親素系統(tǒng)的放大原理，檢測

32、血漿及組織勻漿中微量SEB，該方法靈敏度可達(dá)0.078 ng/ml，檢測范圍為0.078-20ng/ml，血漿中SEB的回收率為88.7-106.2%。,腎臟,蓄積,排泄,腎組織中SEB含量明顯高于其他臟器。,SEB可經(jīng)腎小球自由濾過，并被近端小管細(xì)胞完全重吸收。,腎動脈結(jié)扎和腎切除均可導(dǎo)致體內(nèi)腸毒素的清除延遲，增強(qiáng)其對動物的致死能力。,給家兔靜脈注射125I標(biāo)記腸毒素, 循環(huán)中腸毒素迅速清除，并分布到肝、腎、肺、脾等組織，其中腎臟

33、含量最高。,腎臟是腸毒素蓄積和排泄的最重要場所之一。,,,,,燙傷膿毒癥大鼠臟器功能的改變,y/x 相關(guān)系數(shù)(r) P值 回歸方程GPT/肝臟SEB 0.8462 0.0040 y= 0.4249x+56.2483Cr /腎臟SEB 0.6706 0.04

34、80 y=0.0283x+37.1327CK-MB/心臟SEB 0.7894 0.0114 y= 2.1720x+157.7869MPO/ 肺臟SEB 0.4363 0.2404 ? DAO/血漿SEB -0.4398 0.0170 y=-0.0042x+0.

35、2339,,,,組織SEB與臟器功能指標(biāo)的相關(guān)分析,SEB單抗對燙傷膿毒癥大鼠6小時死亡率的影響 組別 死亡率 P值 燙傷膿毒癥組 55.6% (20/36) SEB單抗組 17.6% (3/17)

36、 0.021,,,,,,,金葡菌腸毒素介導(dǎo)膿毒癥發(fā)病的分子機(jī)制,,干擾素-?,,激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其殺菌活性 (保護(hù)效應(yīng)),炎癥早期,炎癥晚期,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 TNF-?、NO等介質(zhì)大量生成 (損害效應(yīng)),,抗原呈遞細(xì)胞表面 MHC II表達(dá)增加，促進(jìn) T細(xì)胞依賴性休克、MODS,,腸毒素B,,T細(xì)胞活化,,,,JAK2/STAT3 SOCS1/3,,金葡菌致病因子

37、的靶細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞(1) 腸毒素和TSST-1以T淋巴細(xì)胞為主要靶細(xì)胞(介導(dǎo)Th1 細(xì)胞因子反應(yīng)，包括IFN-?)(2) 肽聚糖和磷壁酸則主要作用于單核/巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素的靶細(xì)胞為單核/巨噬細(xì)胞 (以TNF-α促炎因子占優(yōu)勢)，且誘導(dǎo)細(xì)胞因子反應(yīng)速度顯著快于外毒素,,,金葡菌外毒素與內(nèi)毒素作用的差異,,,,金葡菌TSST-1可顯著提高宿主及細(xì)胞對內(nèi)毒素攻擊的敏感性，與內(nèi)毒素發(fā)生致死性協(xié)同作用， 這是該毒素最重要的特

38、性之一。健康家兔單獨接受TSST-1僅表現(xiàn)為發(fā)熱反應(yīng)，即使劑量高達(dá)100 ?g/kg亦不能產(chǎn)生致死效應(yīng)，提示該毒素本身致死性作用并不強(qiáng)。同時給予低劑量內(nèi)毒素與TSST-1，動物即可出現(xiàn)典型的TSS 癥狀和體征， 表現(xiàn)為呼吸、循環(huán)、肝、腎及消化道等多器官功能嚴(yán)重障礙，導(dǎo)致動物死亡。,,,金葡菌外毒素與內(nèi)毒素的協(xié)同效應(yīng),,,,燙傷合并金葡菌感染可導(dǎo)致動物局部組織內(nèi)毒素水平明顯升高，并與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生關(guān)系密切。動物心、肝、肺、腎組織中內(nèi)

39、毒素水平與血漿SEB含量呈正相關(guān)，提示金葡菌攻擊后內(nèi)毒素的升高與SEB毒性作用有關(guān)。燙傷膿毒癥動物血漿SEB 水平與小腸 DAO 活性呈顯著負(fù)相關(guān)，SEB單抗干預(yù)后不僅小腸粘膜的損傷程度有所減輕，組織中內(nèi)毒素水平亦降低。,,,金葡菌外毒素與內(nèi)毒素血癥,,,,在引起膿毒癥的作用方式上，G＋ 菌與G－ 菌具有一定的共性，即二者的細(xì)胞壁產(chǎn)物和毒素均能激活單核 / 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞， 最后誘發(fā)失控性全身炎癥反應(yīng)與多器官功能異常。膿毒癥的發(fā)

40、生并非一定需要內(nèi)毒素的介導(dǎo)，金葡菌及其外毒素同樣可以誘發(fā)膿毒癥。,,,金葡菌與G -菌誘發(fā)膿毒癥的異同,,,,,,,,,,早期炎癥介質(zhì)(TNF)釋放可能與多器官損害相關(guān),HMGB1的產(chǎn)生明顯晚于其他介質(zhì),被稱之為“潛在的晚期介質(zhì)”,?,?,?,?,提示還可能存在TNF-?以外的重要因子介導(dǎo)了內(nèi)毒素的致死效應(yīng),拮抗早期介質(zhì)對臨床病人并沒有明顯的保護(hù)作用,內(nèi)毒素對TNF基因缺陷動物亦具有致死效應(yīng),致死量內(nèi)毒素攻擊，部分動物數(shù)天后才出現(xiàn)死亡,

41、?,,,,,,,,,,內(nèi)毒素,巨噬細(xì)胞,IL-1TNF,HMGB1,損傷休克死亡,,,,,,炎癥介質(zhì)反 應(yīng),“早期”（小時）,“晚期”（數(shù)天）,,?,,是種類最多、含量最豐富的HMG，10~15個核小體即含有一個HMGB分子。HMGB高度保守，人、大鼠、豬和牛的氨基酸序列同源性高達(dá)98%。細(xì)胞內(nèi)、外均有HMGB1表達(dá)。,,,高遷移率族蛋白B, HMGB,,,,,HMGB1 是否確實參與了失控性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過

42、程？HMGB1的誘生機(jī)制及其作用如何？與嚴(yán)重創(chuàng)、燒傷后膿毒癥及器官損害的本質(zhì)聯(lián)系和臨床意義如何？針對HMGB1 進(jìn)行干預(yù)是否有助于膿毒癥及多器官損害的防治？,,,,,,,,,,,,課題擬解決的問題,,HMGB1 mRNA,,腹腔感染膿毒癥大鼠組織HMGB1 mRNA表達(dá),,,*,時間（小時）,對照組 2 6 12 24 48 72,0.96,*,*,*,*,*,*,

43、*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,0.72,0.48,0.24,,,,ALT (u/L),*,正丁酸鈉對膿毒癥大鼠器官功能指標(biāo)的影響,,肝 功,,腎 功,60,50,45,40,55,,,,Cr (μmol/L),*,*,*,,給小鼠腹腔注射純化的重組HMGB1攻擊可出現(xiàn)膿毒癥樣表現(xiàn)較大劑量HMGB1攻擊可導(dǎo)致動物死亡氣管內(nèi)給予HMGB1可引起急性肺損傷，大量P

44、MN聚積和肺水腫,,,,,,,,,,,,HMGB1的直接組織損害作用,,炎性因子 (TNF-α) 上調(diào)HMGB1合成HMGB1對TNF-α/IL-10表達(dá)的影響HMGB1對Toll樣受體表達(dá)的影響,,,,,,,,,,,,HMGB1的調(diào)節(jié)作用,,,,,HMGB1誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)的時間-效應(yīng)關(guān)系,,marker 內(nèi)參 正常 8 h 12 h 24 h 36 h。,正常

45、 8 h 12 h 24 h 36 h,**,**,*,,,,正丁酸鈉對膿毒癥大鼠腎臟TNF-?表達(dá)的影響,,TNF-? mRNA,*,,,,0h 12h 24h,,,,TNF-?蛋白(pg/mg),0h 12h 24h,,*,*,0.8,,0.6,0.4,,,0.2,2.4,1.8,1.2,0,0.6,,,,,,IL-10 (pg/mg蛋白),*,*,,肝

46、臟,,腎 臟,*,*,*,,肺 臟,,,正丁酸鈉對膿毒癥大鼠腎臟IL-10水平的影響,HMGB1對淋巴細(xì)胞免疫功能的影響（包括增殖反應(yīng)、IL-2/IL-2R表達(dá)、Th1/Th2極化）HMGB1對巨噬細(xì)胞吞噬、提呈功能的影響HMGB1與嚴(yán)重?zé)齻蠹?xì)胞免疫功能紊亂的本質(zhì)聯(lián)系及其信號機(jī)制,,,,,,,,,,,,HMGB1的免疫效應(yīng),,,,,,,抗HMGB1抗體對內(nèi)毒素休克小鼠的治療效果,,,,,,,,,,,,,,延遲HMGB1抗體治

47、療組,,,,,,,時間（小時）,2,24,48,72,96,336,,100,75,50,,,0,25,,存活率 （%）,,,,,,,,,,,,,內(nèi)毒素休克對照組,,,,,,正丁酸鈉對嚴(yán)重膿毒癥大鼠的治療效果,,,,,,,,,,,,,,,,,時間（天）,2,1,2,3,4,,100,75,50,,,0,25,,存活率 （%）,,,,,,5,6,7,,,,,,0.5,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,*,*,*,*,*,*,*

48、,*,*,*,*,*,,正丁酸鈉治療組,,嚴(yán)重膿毒癥組,血清HMGB1 (ng/ml),正常對照組,*,*,,,,膿毒癥患者血清HMGB1水平與預(yù)后的關(guān)系,存活組,死亡組,,膿毒癥患者,*,血清HMGB1 (ng/ml),休克初期,,,,失血性休克患者血清HMGB1水平與血壓的關(guān)系,低血壓期,血壓正常,血壓恢復(fù)期,,HMGB1 出現(xiàn)較晚且持續(xù)時間更長，與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)體液中存在穩(wěn)定、持續(xù)，避免“早期”細(xì)胞因子半衰期短

49、、“脈沖”式改變的缺陷可能成為反映膿毒癥、MODS病理過程更為方便、實用的監(jiān)測指標(biāo),,,,,,,,,,,檢測HMGB1的臨床意義,,,生物喋呤及其調(diào)節(jié)作用,一氧化氮 ( NO ) 過度產(chǎn)生是誘發(fā)膿毒性休克和MODS的最后共同通路，而生物喋呤(BH4)為一氧化氮合酶重要的輔因子，調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生。盡管BH4的確切病理效應(yīng)尚未明了，我們的研究發(fā)現(xiàn)，它可能作為潛在“炎癥因子”參與了內(nèi) /外毒素所致膿毒性休克及MODS的病理生理過程。,

50、內(nèi)毒素可刺激多種細(xì)胞中GPT-CHI 基因/蛋白表達(dá)和BH4 產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)iNOS基因表達(dá)。 內(nèi)/外毒素休克動物肝、肺、腎等組織生物喋呤含量分別與反映相應(yīng) 器官損害的功能指標(biāo)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。中和毒素及GPT-CHI抑制劑可不同程度地抑制組織生物喋呤的合成過程。,1,2,生物喋呤在膿毒性休克和MODS中的作用,,3,BH4為iNOS重要輔因子，可促進(jìn)NO不斷合成、釋放；NO 大量誘生加重內(nèi)毒素所致血流動力學(xué)障礙、細(xì)胞毒作用和局

51、部組織損傷。BH4與內(nèi)/外毒素在誘導(dǎo) iNOS 表達(dá)及促進(jìn)TNF-a產(chǎn)生方面具有協(xié)同效應(yīng), 可造成廣泛炎癥反應(yīng)。采用 GTP-CHI 抑制劑或 BH4競爭抑制劑能有效拮抗低血壓，提高多器官微循環(huán)灌注。膿毒癥時BH4與MAPK p38激活密切相關(guān)。,1,2,生物喋呤介導(dǎo)組織損傷效應(yīng)的機(jī)理,,3,4,新喋呤在體液中存在較穩(wěn)定，持續(xù)時間長，不易滅活或降解，克服了某些炎性介質(zhì)作為早期診斷指標(biāo)的缺陷。 通過64例大面積燒傷和41例

52、多發(fā)傷病人前瞻性觀察，確立了新喋呤對嚴(yán)重膿毒癥的預(yù)警閾值(35.0 nmol/L) 。嚴(yán)重?zé)齻笱h(huán)新喋呤水平改變較早，自傷后 3 天起并發(fā)MODS者其含量持續(xù)上升，比臨床出現(xiàn)MODS提前數(shù)天作出判斷。發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測新喋呤和內(nèi)毒素能進(jìn)一步提高M(jìn)ODS的臨床診斷效率。,新喋呤與創(chuàng)、燒傷后嚴(yán)重膿毒癥及MODS的關(guān)系,,,,,,,血清新喋呤含量與MODS積分值的關(guān)系,傷后時間（天） 項 目

53、 1 3 7 14 21 28 新喋呤/積分值 r值 -0.177 0.470 0.722 0.264 0.811 0.080 P值 >0.05 0.05 0.05,,,,,,敏感性 特異性 準(zhǔn)確性

54、 陽性 陰性 預(yù)測值 預(yù)測值新喋呤 81.8 89.9 86.8 81.1 89.9內(nèi)毒素 92.6 82.7 86.2 74.6

55、 95.3新喋呤合并內(nèi)毒素 90.2 96.4 94.7 90.2 96.4,新喋呤、內(nèi)毒素、新喋呤合并內(nèi)毒素 對MODS的診斷有效率比較（%),,,,,,內(nèi)毒素 外毒素細(xì)胞壁 等,,,炎癥介質(zhì)(TNF-?, IFN-?、IL-1等),,,,,iNOS,,GTP-CHI,,,,,,,精氨酸,,胍氨酸,+,NO,,血管擴(kuò)張,,循環(huán)障礙,,Mon

56、/M? 細(xì)胞平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞等,,,,,,DAHP,,,iNOS活性,,生物喋呤對iNOS的調(diào)控機(jī)制,BH4,?,GTP-CHI,,DAHP,生物喋呤,原生型NOS 誘生型NOS,NO基礎(chǔ)水平 抑制大量NO釋放,,,,,DAHP對膿毒性休克的防護(hù)效應(yīng),,,,,,,基因組與蛋白組學(xué),傳統(tǒng)模式中多數(shù)實驗性研究集中于某一信號分子、動物模型中的幾個相關(guān)分子或者培養(yǎng)獨立的細(xì)胞及細(xì)胞系。為了達(dá)到全面

57、理解的目的，需要同時分析許多不同的分子及其相互作用，并運用定量的模擬方法總結(jié)這些數(shù)據(jù)以闡明能夠用于直接治療的關(guān)鍵信號結(jié)點。,,,,膿毒癥蛋白組學(xué),蛋白組被定義為細(xì)胞、組織或機(jī)體中表達(dá)的所有蛋白的含量和種類；蛋白組方法可分為三種不同的類型：即表達(dá)蛋白組、結(jié)構(gòu)蛋白組和功能蛋白組；功能蛋白組探討蛋白質(zhì)之間的相互作用和翻譯后的修飾并對其進(jìn)行調(diào)節(jié)，集中于調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中分子的相互作用，是深入了解膿毒癥分子機(jī)制的核心環(huán)節(jié)。,,,,,膿毒癥

58、蛋白組學(xué),利用蛋白組學(xué)研究策略，將來人們可以精確計算并鑒定導(dǎo)致膿毒癥分子病理學(xué)改變的信號網(wǎng)絡(luò)中重要的結(jié)合點。一旦找出其關(guān)鍵的信號中樞，就可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化合理的藥物設(shè)計，從而生產(chǎn)出體內(nèi)更有效、副作用更小的特異性調(diào)節(jié)劑。,,,,神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò),電刺激迷走神經(jīng)傳出支激活膽堿能抗炎途徑可抑制膿毒癥多器官TNF-α產(chǎn)生，減少膿毒性休克的發(fā)生率。迷走神經(jīng)切除顯著提高炎癥刺激下 TNF-α合成與釋放 ，增強(qiáng)內(nèi)毒素對動物的致死性。膽堿

59、能抗炎途徑可特異性抑制局部炎癥。利用膿毒癥的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制來探討其防治策略是一個較新的研究領(lǐng)域，目前尚處于探索階段。,,近年來的研究證實，免疫功能紊亂在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中確實具有重要作用。機(jī)體往往有短暫的SIRS，隨后是長期的CARS和MARS。SIRS表現(xiàn)為非特異性免疫系統(tǒng)高度活躍和炎癥反應(yīng)亢進(jìn)；CARS表現(xiàn)為特異性免疫系統(tǒng)的抑制 。,膿毒癥與炎癥及免疫功能紊亂,T淋巴細(xì)胞的克隆無反應(yīng)狀態(tài),抑制性細(xì)胞因子作用,細(xì)胞凋亡和凋亡細(xì)胞作

60、用,,,DC/巨噬細(xì)胞,IL-12,IFN-γ,IL-10,PGE2,Th0,Th2,Th1,,,,,,,,,,,,,,,,,,CD4+T淋巴細(xì)胞的功能性分化,細(xì)胞凋亡本是細(xì)胞死亡的被動和正常生理過程。但膿毒癥中，細(xì)胞凋亡加速，成為主動的病理過程。已證實，誘導(dǎo)膿毒癥細(xì)胞凋亡加速的主要物質(zhì)是促炎細(xì)胞因子，如TNFα、FasL、顆粒酶等和糖皮質(zhì)激素。,T 細(xì) 胞,,TNFαFasL顆粒酶糖皮質(zhì)激素,TNFαFasL顆粒酶糖皮質(zhì)激

61、素,,,,,,抗原刺激,,＋,無刺激,,主 動 凋 亡,被 動 凋 亡,細(xì)胞的正常凋亡與加速凋亡,膿毒癥誘導(dǎo)器官凋亡的實驗研究,,作 者 模型 胸腺 脾臟 肝臟 肺臟 腸道,,Fukuzuka, 1999 燒傷 ＋＋ ＋＋ －

62、 ＋ －,Mignon, 1999 LPS ＋＋,Chung, 1998 CLP ＋＋,Hotchkiss

63、, 1997 CLP ＋＋ ＋＋ ± ＋ ＋,Hiramatsu, 1997 CLP ＋＋ ＋ ＋ ＋,Ayala, 1996 CLP

64、 ＋＋,Wang, 1994 G+菌血癥 ＋＋,,注：＋＋廣泛凋亡；＋明顯凋亡；±輕度凋亡；－無凋亡,膿毒癥時間愈長,T細(xì)胞和B細(xì)胞的缺失愈加明顯,大部分患者死于長期的低免疫狀態(tài)期。 ------《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》 The New England Journal of Medicine

65、 (2003). 348; 138-150.,膿毒癥免疫反應(yīng)示意圖,打 擊,,,化學(xué)物質(zhì)：自由基、蛋白酶物理損傷：機(jī)械、熱力抗 體補(bǔ) 體,,細(xì)胞膜損傷,,,,,,,細(xì)胞壞死,,炎癥反應(yīng),MO,NK,CD8,Th1,激素,TNFα,顆粒酶,FasL,,,,,,,,非細(xì)胞膜損傷,,細(xì)胞凋亡,,,,,,,非特異性全身炎癥反應(yīng)↑ 特異性免疫功能↓,胸腺肽對膿毒癥的免疫調(diào)理作用,激活低下的特異性免疫：

66、 促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化成熟和單核細(xì)胞抗原呈遞，阻止特異性免疫細(xì)胞凋亡。拮抗亢進(jìn)的非特異性免疫反應(yīng)： 降低循環(huán)內(nèi)毒素及促炎介質(zhì)水平, 增加抗炎介質(zhì)的水平。,,Th1,,IFN-?,LT,,,巨噬細(xì)胞(增強(qiáng)殺菌能力),+,,,+,嗜中性細(xì)胞(增強(qiáng)殺菌能力),,,,,IL-2,,+,,,,,調(diào)節(jié)CD4+/CD8+比例,(增強(qiáng)機(jī)體免疫水平),胸腺肽→,α1胸腺肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠炎癥介質(zhì)的影響,,Alan Goldstein,

67、Thymosin a1 reduces blood level of IL-1, PAF and metabolites in mice treated with lethal doses of endotoxin,增加巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞吞噬及殺菌能力,取自無感染的小鼠支氣管肺泡巨噬細(xì)胞和外周中性細(xì)胞 , 預(yù)先用Tα1培養(yǎng), 后暴露于孢子, 測定吞噬能力和殺孢子能力,*Thymosin and Dendritic cells in

68、 Aspergilosis. Blood, 2004, 103(11): 4237,膿毒癥患者28天生存情況比較 對照組 治療組 28天結(jié)局N(Nmiss) 134 ( 0 ) 141 ( 0 ) 存活 77 (57.46%) 108(