實(shí)驗(yàn)二 植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)二 植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定,植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-植物生理部分,NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田間條件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。,硝酸鹽的還原,硝酸鹽,硝酸還原酶,亞硝酸鹽,氨,,亞硝酸還原酶,,硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，在植物體內(nèi)本來不含有，但在特定外來物質(zhì)的如NO3-誘導(dǎo)下可以生成硝酸還原酶。,硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽： NO3- +N

2、ADH + H+ NO2- +NAD+ +H2O 產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酸（或?qū)Π被交酋０罚┘唉?- 萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。,【實(shí)驗(yàn)原理】,生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以單位時(shí)間內(nèi)每克鮮重含氮量表示，即以µg/g/h為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡(jiǎn)單，適

3、合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。,,小麥的新鮮葉片（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組）,【實(shí)驗(yàn)材料】,⑴冷凍離心機(jī)；⑵分光光度計(jì)；⑶天平 (0.01g)；⑷冰箱；⑸恒溫水??；⑹研缽；⑺剪刀；⑻離心管；⑼移液管(5、2、1mL) ；⑽洗耳球；⑾試管架；(12)膠頭滴管。,【實(shí)驗(yàn)器材】,標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按下表順序加入試劑，配成0-0.20µg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25℃下

4、保溫30min，然后在540nm下比色測(cè)定。以亞硝態(tài)氮濃度（µg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（r）建立回歸方程。,【實(shí)驗(yàn)步驟】,,,,酶的提取 稱取0.5-1g 鮮樣（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組分別進(jìn)行），剪碎置冰箱冰凍30min，取出置研缽中，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移入離心管中，洗研缽2-3次，將液體轉(zhuǎn)入離心管中，共用提取液6 mL，4℃ 8000rpm離心15min，上清液即為粗酶提取液。酶反應(yīng) 取4個(gè)10 mL離心

5、管，按照下表所列進(jìn)行操作，混勻，25℃保溫30min。,終止反應(yīng)和比色測(cè)定 30min后立即加入l mL磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加l mL萘基乙烯胺溶液，顯色30min后于4000rpm離心5min，取上清液在540nm下比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)液中亞硝態(tài)氮濃度（µg/mL ）。,【結(jié)果計(jì)算】,樣品中酶活性（µg ·g-1·h-1）= X ——反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮濃度（&#

6、181;g/mL）；V1——提取酶時(shí)加入的提取緩沖液體積（mL）；V2——酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積（mL）；V3——與磺胺等發(fā)生顏色反應(yīng)的總體積（mL）； W ——樣品質(zhì)量（g）； t ——反應(yīng)時(shí)間（h）。,,【注意事項(xiàng)】,硝酸還原酶容易失活，離體法測(cè)定時(shí)，操作應(yīng)迅速，并且在4℃下進(jìn)行。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，從顯色到比色時(shí)間盡可能保持一致，顯色時(shí)間過長(zhǎng)或過短對(duì)顏色都有影響。,【思考與作業(yè)】,比色測(cè)定前加入磺胺和萘基乙烯胺的順序不