內(nèi)生細(xì)菌Pantoea ananatisSd-1降解水稻秸稈性能與漆酶催化性質(zhì)的研究.pdf

1、我國(guó)水稻秸稈資源豐富，但由于其難降解的特征，限制了其開(kāi)發(fā)利用。利用微生物資源實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻秸稈資源的降解研究，已日趨成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。Pantoea ananatis Sd-1是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株具有高效降解水稻秸稈能力的水稻內(nèi)生細(xì)菌，為了進(jìn)一步探索 Sd-1降解水稻秸稈的條件及其對(duì)木質(zhì)纖維素材料的降解機(jī)理，本文主要開(kāi)展了以下三部分的研究。
　?。?）最佳條件探索與成分分析利用水稻秸稈為唯一碳源，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與三因素三水

2、平的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到了Sd-1降解水稻秸稈的最佳組合條件為接種量1.5％、pH10、秸稈含量2.5%，在該條件下，Sd-1對(duì)秸稈的降解率為46%。以預(yù)處理水稻秸稈為唯一碳源，連續(xù)6天研究了Sd-1對(duì)預(yù)處理水稻秸稈的降解率，在第3天達(dá)到最大值61.8%。通過(guò)GC-MS分析預(yù)處理秸稈降解后發(fā)酵液的成分，鑒定出了一些構(gòu)成木質(zhì)素的低分子苯化合物（如苯酚、苯乙酸等）以及一些酸類物質(zhì)。
　?。?）酶活變化與降解能力的研究定性培養(yǎng)基檢測(cè)，確定了

3、Sd-1具有分泌過(guò)氧化物酶、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力。以預(yù)處理秸稈為唯一碳源，連續(xù)6天檢測(cè)了上述四種木質(zhì)纖維素降解酶在秸稈降解過(guò)程中的活性變化，發(fā)現(xiàn) Sd-1產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、漆酶和纖維素酶的活性均在第3天達(dá)到最大值，分別為5.9 U/mL、600 U/L和295 U/mL，而產(chǎn)生的半纖維素酶在第一天即達(dá)到最大值1345 U/mL。通過(guò)對(duì)預(yù)處理秸稈中的木質(zhì)纖維素組分含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn) Sd-1對(duì)秸稈中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的

4、降解率在第六天分別達(dá)到了35.62%、78.8%和75.2%。
　　（3）漆酶的克隆與純化通過(guò)對(duì)Sd-1全基因組的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)四段CDS序列（lac1-lac4）可能編碼漆酶。進(jìn)一步的進(jìn)化樹(shù)分析、同源序列分析與三維結(jié)構(gòu)分析，確定Lac4為典型的細(xì)菌漆酶。對(duì)Lac4進(jìn)行克隆與原核表達(dá)，SDS-PAGE顯示其分子量約為60 kDa，Lac4酶活在以ABTS為底物時(shí)的最佳pH為2.5，在愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)的pH為4.5。Lac4具

5、有極度耐酸性，金屬離子穩(wěn)定性且受到Fe2+與Cu2+顯著促進(jìn)。 Lac4具有氧化非酚型（ABTS）和酚型（愈創(chuàng)木酚）化合物的能力，對(duì)ABTS的親和性 Km值達(dá)到1.03±0.154 mM。Lac4具有使染料脫色能力，尤其是能快速有效使剛果紅脫色，在有介質(zhì)ABTS的存在下，其脫色率可達(dá)89%；Lac4在體外試驗(yàn)中能使木質(zhì)素的降解率達(dá)到38%，通過(guò)GC-MS分析Lac4降解木質(zhì)素后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了一些小分子的苯環(huán)化合物如苯酚、鄰苯二甲醛、苯二