法學(xué)]第五章分子熒光分析法

1、,第五章 分子熒光分析法,,1.分子熒光分析分析法的基本原理（了解）,3.影響熒光強(qiáng)度的因素（熟悉）,2.分子熒光分析儀器的結(jié)構(gòu)及類型及新技術(shù)（了解）,4.分子熒光分析法的基本概念、熒光光譜、 激發(fā)光譜、定量分析的依據(jù)（掌握）,,發(fā)光分析法：物質(zhì)吸收一定能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)以輻射的形式釋放能量返回低能態(tài)或基態(tài)的現(xiàn)象所建立的分析方法。,,光致發(fā)光： 以光能激發(fā)而產(chǎn)生的發(fā)光,熒光和磷光,光照、加熱、化學(xué)反應(yīng)、生物代

2、謝等,熒光分析法：利用物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。,,定性鑒別： 由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長(zhǎng)和發(fā)射光的波長(zhǎng)也不同。,定量分析：如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強(qiáng)度就不同。,1. 根據(jù)發(fā)光物質(zhì)分類：分子熒光與原子熒光,,2. 根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)范圍分類： 紫外-可見熒光、紅外熒光、X射線熒光,熒光分析法分類,熒光分析法特點(diǎn)： 靈敏度高、

3、選擇型好、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便,第一節(jié) 基本原理,一、分子熒光的產(chǎn)生,1.電子激發(fā)態(tài)的多重度,電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；,大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；,2.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑,電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；,非輻射能量傳遞過程,振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高 振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍

4、 遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。,內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無輻射能 級(jí)交換。,通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。,非輻射能量傳遞過程,外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生 相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。,系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的

5、 非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行,輻射能量傳遞過程,發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)； ? ‘2 > ? 2 > ? 1,熒光：10-7～10 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；,磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；,二、激發(fā)光譜與熒光(磷

6、光)光譜,固定熒光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)光波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 （圖中曲線I ） 。,選最強(qiáng)熒光強(qiáng)度的激發(fā)光波長(zhǎng)λex為測(cè)定波長(zhǎng)，以提高靈敏度。,1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線,2.熒光光譜(或磷光光譜),固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與激發(fā)光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。,2. 三維熒光光譜,I F ∝f (λex 、λem),蒽的激發(fā)光譜,固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描

7、激發(fā)波長(zhǎng),I F ∝f (λex 、λem),蒽的發(fā)射光譜,固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng),VB1和VB2的三維熒光光譜,3. 熒光光譜的特征,a. Stokes位移:熒光光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng),b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān),c. 與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系,通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。,鏡像規(guī)則的解釋,基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；,基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振

8、動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。,,,,,,,,,,200,,250,,300,,350,,400,,450,,500,,熒光激發(fā)光譜,,熒光發(fā)射光譜,,nm,,,,蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜,三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件,熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。,（1）具有強(qiáng)的紫外-可見吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大π鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（?）,

9、（1）具有強(qiáng)的紫外-可見吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大π鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（?）,2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光,（1）躍遷類型：?* → ?的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；,（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移,（3）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強(qiáng) 吸電子基，使熒光減弱甚至熄滅,2.化

10、合物的結(jié)構(gòu)與熒光,（4）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。,四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系,,稀溶液,五、影響熒光強(qiáng)度的因素,2. 溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。,3. 溶液pH 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。,1. 溫度的影響

11、 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去激活的幾率減少，增加熒光效率，從而增加熒光強(qiáng)度。,pH值,pH13,弱酸、弱堿,藍(lán)色熒光,4. 散射光：,瑞利散射光：選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y(cè)定波長(zhǎng)或選用濾光片可消除,拉曼散射光：選擇適當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)的方法消除,一部分光由于光子與物質(zhì)分子的相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同方向散射。,硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與拉曼光譜(b),熒光光譜,拉曼光譜,瑞利光320nm,拉曼光360nm

12、,拉曼光400nm,熒光448nm,激發(fā)320nm,激發(fā)350nm,瑞利光350nm,5. 熒光熄滅,熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象。,熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。,如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。,熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度超過1g/L時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。,熒光熄滅法：

13、利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。,(濃度限量1?g~1mg/ml),930型熒光計(jì)光路示意圖,激發(fā)濾光片,發(fā)射濾光片,?,第二節(jié) 熒光分析儀器,一. 主要組成及部件的功能,熒光分光光度計(jì)工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖,光源,氙燈,激發(fā)單色器,樣品池,光電倍增管,數(shù)據(jù)處理儀器控制,,,,,,發(fā)射單色器,問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？,,熒光分析儀器的主要部件,激發(fā)光源

14、：汞燈、鹵鎢燈、氙燈、分光系統(tǒng)：濾光片（兩個(gè)）、單色器（光柵）樣器池：低熒光材料或石英材料，四面透光檢測(cè)器：紫外-可見（光電倍增管）顯示系統(tǒng)：指針式、數(shù)字式及計(jì)算機(jī)顯示,二、熒光分析儀器的類型,1.熒光光度計(jì),2.熒光分光光度計(jì),熒光分光光度計(jì),熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖,分光系統(tǒng)：光柵用途：測(cè)定激發(fā)光譜、熒光光譜及定量分析。,最大激發(fā)波長(zhǎng)?exmax和最大熒光波長(zhǎng)?emmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)和定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件。,激發(fā)單色

15、器,發(fā)射單色器,熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別,入射光與吸收光同方向,入射光與熒光垂直方向,兩種光源(紫外+可見),一種光源(紫外),空白溶液(F=0)熒光對(duì)照品溶液(F=100%或50%),空白溶液(T=100%),紫外無吸收兩面透光,低熒光材料四面透光,紫外-可見分光光度計(jì):,熒光(磷光)分光光度計(jì):,,,,,,,,,,,,紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量池(吸收池),熒光分光光度計(jì)樣品池,I0,It,I0,It,IF,p

16、,第三節(jié) 定性和定量分析,定量依據(jù)：F=Kc,定性依據(jù)熒光光譜和激發(fā)光譜,一、定性分析,二、定量分析,1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法,直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法,2.直接比較法,第四節(jié) 熒光分析新技術(shù),激光熒光分析,時(shí)間分辨熒光分析,一、熒光新技術(shù),三維熒光分析,核酸分子熒光探針,薄層掃描法中的熒光掃描法,熒光分析的應(yīng)用,1.有機(jī)化合物的熒光分析,研究對(duì)象：芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物,有機(jī)化合物：多環(huán)胺類、萘酚類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)

17、藥物：生物堿類；甾體類；抗生素類(青霉素、四環(huán)；維生素類(維生素A、B1、B2、B6、B12等)中草藥：有效成分（芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類）,熒光試劑,熒光胺,熒光條件： ?ex=275、390nm， ?em=480nm,適用：脂肪族和芳香族伯胺,鄰苯二甲醛(OPA),適用：伯胺類、?-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸）熒光條件： ?ex=340nm， ?em=455nm (2-巰基乙醇存在，pH9~10的緩沖溶液),

18、2.無機(jī)化合物的熒光分析,測(cè)定方法：與具有π電子共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物形成熒光配合物研究對(duì)象陽離子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr陰離子：CN-、F-與Al、Zr離子強(qiáng)烈配合→原有熒光配合物的熒光減弱甚至熄滅,[課后練習(xí)],名詞解釋：熒光與磷光、振動(dòng)弛豫溶液熒光光譜有哪些特征？能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)分子應(yīng)

19、同時(shí)具備哪些條件？為什么熒光分析法適用于稀溶液的測(cè)定？,填空題,1．熒光是 物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的                返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光,2．熒光和磷光的區(qū)別在于熒光是從單線激發(fā)態(tài)開始的，磷光是由    

20、60;            。,3．熒光發(fā)射光譜也稱熒光光譜，其發(fā)射波長(zhǎng)總是            激發(fā)波長(zhǎng)。,4．能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)應(yīng)具備的條件是     &

21、#160;         、                 。,5．影響熒光強(qiáng)度的外部因素有         

22、60;       。,選擇題,1．熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與紫外吸收光譜的形狀：（  ）     A．完全一樣 B．基本相似     C．肯定不一樣 D．難以說清,B,2．對(duì)熒光測(cè)定最有干擾的是：（  ）

23、     A．波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的瑞利光 B．波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的拉曼光      C．波長(zhǎng)比入射光短的瑞利光 D．波長(zhǎng)比入射光短的拉曼光,B,3．下列對(duì)熒光的敘述正確的是：（  ）     A．從第一電子激發(fā)態(tài)的不同能級(jí)發(fā)出光量

24、子回到基態(tài) B．從激發(fā)三線態(tài)的不同能級(jí)發(fā)出光量子回到基態(tài)     C．從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)發(fā)出光量子回到基態(tài) D．從激發(fā)三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)發(fā)出光量子回到基態(tài),C,1. 體系間跨躍是因?yàn)榧ぐl(fā)態(tài)分子和溶劑分子發(fā)生碰撞而交換能量所致。( ),判斷題,2. 熒光光譜的形狀不僅與物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，而且還與激發(fā)波長(zhǎng)有關(guān)。 （  ）,3. 一般而言，分子的