認(rèn)識(shí)核酸在生命科學(xué)上重要性

1、不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,1,核 酸,,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,2,認(rèn)識(shí)核酸在生命科學(xué)上的重要性弄清堿基、核苷、核苷酸和核酸分子結(jié)構(gòu)上的關(guān)系了解核酸的化學(xué)本質(zhì)及DNA和RNA在組分、結(jié)構(gòu)和功能上的差異認(rèn)識(shí)核酸的結(jié)構(gòu)與其性質(zhì)與功能之間的關(guān)系。,學(xué)習(xí)要求,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,3,1868年 F.Mi

2、escher首先從傷員繃帶的膿細(xì)胞中分離得到稱為“核素”的核酸1944年 O.N.Avery通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA是主要的遺傳物質(zhì)1953年 J. D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則1970s 建立DNA重組技術(shù)1980s后 分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科突飛猛進(jìn)發(fā)展，提出并完成HGP,核酸化學(xué)的發(fā)展過(guò)程,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,一. 核酸的概念和

3、重要性二. 核酸的化學(xué)組成及其基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸三. 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其測(cè)定四. DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)五. RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)六.核酸和核苷酸的理化性質(zhì)七.核酸的分離提取和純化,本章目錄,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,5,一.核酸的概念和重要性,,核酸的概念核酸的重要性,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,6,核酸的概念,核酸是酸性的大分

4、子物質(zhì)，在活細(xì)胞中與堿性蛋白結(jié)合，以核蛋白形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸 ( DNA )以及核糖核酸 (RNA)兩類，DNA所含核苷酸分子數(shù)比RNA大得多。 RNA分為三個(gè)類型，即核蛋白體 RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)和轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)，它們都參與蛋白質(zhì)合成,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,7,脫氧核糖核酸和核糖核酸異同的對(duì)比,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,

5、不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,8,DNA和RNA,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,9,DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，負(fù)責(zé)遺傳信息的貯存和發(fā)布，遺傳基因就是DNA鏈上的若干核苷酸所組成的片段。RNA負(fù)責(zé)遺傳信息的表達(dá)，直接參與蛋白質(zhì)生物合成，轉(zhuǎn)錄DNA所發(fā)布的遺傳信息，并將之翻譯給蛋白質(zhì)，使生命機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳得以繼續(xù)進(jìn)行。,核酸的重要性,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞

6、步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,10,核酸類物質(zhì)RNA的重要功能,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,11,二.核酸的化學(xué)組成及其基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸,,核酸的化學(xué)組成核酸的基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,12,核酸的化學(xué)組成,元素組成：C、H、O、N、PP元素的含量較多并且恒定，約占9～11%。核酸在酸、堿或酶作用下會(huì)

7、水解成核苷酸，進(jìn)一步水解可得堿基(嘌呤或嘧啶)，戊糖(核糖或脫氧核糖) 和磷酸,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,13,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。,(一)戊糖,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,14,(二)堿基(嘌呤和嘧啶）,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，

8、無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,15,常見(jiàn)的嘌呤和嘧啶,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,16,(三)核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,嘧啶核苷,嘌呤核苷,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,17,,幾種稀有核苷,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)

9、以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,18,,幾種稀有核苷,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,19,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,嘧啶核苷,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,20,（四）核苷酸（nucleotide）脫氧核苷酸,上頁(yè) 下頁(yè) 章首

10、 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,21,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,22,（五）核苷酸衍生物,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,1. 繼續(xù)磷酸化,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,23,（五）核苷酸衍生物,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,不積蹞步，無(wú)以

11、致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,24,3. 肌苷酸及鳥(niǎo)苷酸(特鮮味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,,IMP GMP,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,25,三. 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其測(cè)定,核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)核苷酸序列分析,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里

12、；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,26,核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是核酸中各核苷酸化學(xué)鍵連接方式即核苷酸排列順序。 核苷酸通過(guò)3’，5’-磷酸二酯鍵連接起來(lái)，以磷酸-糖-磷酸-糖…形成核酸骨架,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,27,RNA，DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,28,

13、核酸的表示方式,DNA RNA,5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′ 或5′ACGTGCGT 3′ 5′ACGUAUGU 3′ ACGTGCGT

14、 ACGUAUGU,若不特別注明，一般規(guī)定從5′端書寫至 3′端,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,29,核酸分子的核苷酸序列分析是以純品核酸為材料，經(jīng)水解，測(cè)定核苷酸組成及比例。先以外切酶確定5’-或3’-末端核苷酸，再以內(nèi)切酶將核酸鏈分為若干寡核苷酸段，分段測(cè)定核苷酸組成、比例和序列。最后將核苷酸序列的各寡核苷酸重疊，確定整個(gè)核酸分子的

15、核苷酸序列。,核酸序列分析,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,30,核苷酸序列分析中斷裂磷酸二酯鍵用酶,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,31,DNA酶法測(cè)序,1977年sanger發(fā)明末端終止法測(cè)定DNA序列根據(jù)sanger測(cè)序法，現(xiàn)在已經(jīng)有各種DNA自動(dòng)測(cè)序儀，DNA測(cè)序速度大大加快HGP得以提前完成,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里

16、；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,32,DNA酶法測(cè)序,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,33,DNA酶法測(cè)序,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長(zhǎng)度的、不同長(zhǎng)短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過(guò)聚丙烯酸胺

17、凝膠電泳按鏈的長(zhǎng)短分離開(kāi)，經(jīng)過(guò)放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測(cè)DNA的核苷酸序列,如下圖所示：,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,34,DNA酶法測(cè)序,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,35,DNA酶法測(cè)序,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,36,四. DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu),DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的三級(jí)結(jié)

18、構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,37,DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，即兩條多聚核苷酸鏈圍繞一個(gè)共同軸，相互盤繞在一起構(gòu)成直徑 2nm的雙螺旋，互補(bǔ)的堿基(A和T互補(bǔ) ，G和C互補(bǔ))通過(guò)氫鍵連接在螺旋內(nèi)部，堿基平面垂直于右旋的螺旋軸。螺旋結(jié)構(gòu)中兩條鏈走向相反,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,38,DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型,

19、上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（A＝T，G≡C）堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周為10堿基對(duì)（bp）A型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜20º，螺旋變粗變短，螺距2～3nm。Z型結(jié)構(gòu) 左手螺旋，只有小溝,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,39,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)示意圖,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友

20、情分享,40,DNA的分子節(jié)段及堿基配對(duì)示意圖,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,41,穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的三種力量氫鍵：使四種堿基形成特異配對(duì)關(guān)系，G-C間可形成3對(duì)氫鍵，A-T之間有兩對(duì)氫鍵 。疏水相互作用：軸向平行相鄰的堿基平面自發(fā)地相互靠近，從而使堿基締合、層層堆積，形成了堿基堆積力 ，它是使DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要力量。 離子鍵：磷酸殘基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的正離子，如Na+，K+，Ｍg＋等之間形

21、成的離子鍵。,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,42,,核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)指鏈狀核酸分子的空間構(gòu)型，即其三維空間排列或組合方式。,DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,43,DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要有以下三種：,松弛環(huán)形,超螺環(huán)形,開(kāi)鏈環(huán)形,DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成

22、江海 友友情分享,44,回文結(jié)構(gòu)與鏡像結(jié)構(gòu),特殊DNA的結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,45,回文結(jié)構(gòu)中的單鏈可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),特殊DNA的結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,46,雙鏈回文結(jié)構(gòu)可形成十字架結(jié)構(gòu),特殊DNA的結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,47,五. RN

23、A的高級(jí)結(jié)構(gòu),RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,48,RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是單股分子，其二級(jí)結(jié)構(gòu)比DNA簡(jiǎn)單的多，但也存在少數(shù)堿基配對(duì)區(qū)域即雙螺環(huán)結(jié)構(gòu)。,,RNA單鏈的折疊,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,49,（1）占總RNA的15％（2）一種氨基酸對(duì)應(yīng)最少一種RNA（3）分

24、子中含有較多修飾成分（4） 3‘-末端都具有CCAOH結(jié)構(gòu)（5）半數(shù)堿基可經(jīng)過(guò)自身回折，形成局部雙螺旋“莖” 結(jié)構(gòu)，其間是單鏈形成的“環(huán)”。絕大多數(shù)tRNA經(jīng)過(guò)這樣的折疊形成4個(gè)莖和4個(gè)環(huán)組成的特征性三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu) 。,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,1、tRNA,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,50,占總RNA的80％,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,2、rRNA,5sRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),不積蹞步，無(wú)以致千里；不積

25、小流，無(wú)以成江海 友友情分享,51,占總RNA的3％～5％,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,3、mRNA和hnRNA,真核細(xì)胞mRNA的3‘-末端有一段長(zhǎng)達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ，5’ -末端有一個(gè)甲基化的鳥(niǎo)苷酸，稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,52,占總RNA的3％～5％,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,3、mRNA和hnRNA,原核生物mRNA特征：

26、 先導(dǎo)區(qū)+翻譯區(qū)（多順?lè)醋樱?末端序列真核生物mRNA特征： “帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+單順?lè)醋?“尾巴”（Poly A）,原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),,真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,55,在tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中未配對(duì)的某些并不互補(bǔ)的堿基參與了三級(jí)結(jié)構(gòu)中特殊的氫鍵作用，tRNA鏈中的核糖-磷酸骨架與某些堿基甚至其他的骨架之間也

27、能產(chǎn)生作用。,RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,56,六.核酸和核苷酸的理化性質(zhì),核苷是無(wú)色的晶體或粉末，熔點(diǎn)較高。在水中的溶解度嘧啶核苷比嘌呤核苷大，在有機(jī)溶劑中一般不溶解。由于戊糖有不對(duì)稱的C原子，使其具有旋光性。  天然DNA分子長(zhǎng)度可達(dá)幾厘米，而分子直徑只有20埃米。這種細(xì)絲狀的雙螺旋結(jié)構(gòu)賦于DNA 一系列顯著的物理化學(xué)特性。 由于RNA分子比D

28、NA短` 而且小的多,只有部分雙螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，呈不定形，沒(méi)有像 DNA那樣明顯的物理、化學(xué)特性。,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,57,沉降特性高分子量高粘度紫外吸收酸堿性質(zhì)變性復(fù)性,核酸和核苷酸的理化性質(zhì),上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,58,溶液中的核酸在引力場(chǎng)中可以下沉，在超速離心機(jī)造成的極大的引力場(chǎng)下，核酸分子下沉的速率大大加

29、快。應(yīng)用超速離心技術(shù)，可以測(cè)定核酸的沉降常數(shù)、分子量和構(gòu)象。測(cè)定DNA分子量時(shí)，由于它的粘度大，應(yīng)采用其稀溶液。,沉降特性,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,59,目前核酸的分子量用電子顯微鏡照相，放射自顯影凝膠電泳等技術(shù)來(lái)測(cè)定。部分核酸分子量和核苷酸數(shù)：,,,高分子量,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,60,DNA的粘度比RNA的大得

30、多。當(dāng)核酸溶液因受熱或在其他因素作用下發(fā)生螺旋向線性過(guò)渡時(shí)，粘度會(huì)降低。,高粘度,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,61,由于核酸組分嘌呤和嘧啶具有強(qiáng)烈的紫外吸收性能，所以核酸也有強(qiáng)烈的紫外吸收，最大吸收值在260nm處。這可作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。,紫外吸收,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,62,酸堿性質(zhì),上頁(yè) 下頁(yè)

31、章首 節(jié)首,核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時(shí)泳向正極。,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,63,在一定物化因素(熱、酸、堿 作用下)，DNA分子內(nèi)的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)，發(fā)生變性。 RNA僅局部呈雙螺旋結(jié)構(gòu)，其螺旋形結(jié)構(gòu)向線團(tuán)形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化不如DNA明顯

32、。核酸降解、變性時(shí)，其對(duì)紫外吸收增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)變性DNA在適當(dāng)條件下(如緩慢冷卻)可使兩條分開(kāi)的鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這過(guò)程叫復(fù)性。復(fù)性過(guò)程產(chǎn)生減色效應(yīng),變性與復(fù)性,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,64,DNA熱變性及復(fù)性示意圖,返回,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,65,DNA熱變性的Tm值,返回,DNA的變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)

33、間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時(shí)的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85?C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)，G和C的含量高，Tm值高。可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,66,七.核酸的分離提取和純化,DNA的分離RNA的分離核酸含量測(cè)定：定磷法

34、 紫外線吸收法 定糖法核酸的純化及其要求,上頁(yè) 下頁(yè) 章首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,67,核蛋白的提?。赫婧思?xì)胞中DNA常和組蛋白結(jié)合以核蛋白形式存在，把真核細(xì)胞搗碎后加入0.9%NaCl和0.01M檸檬酸鈉溶液，使DNA蛋白質(zhì)沉淀，而檸檬酸鈉是起抑制DNA的降解作用。核酸與蛋白質(zhì)的分離：利用核蛋白溶于1mol /L Na

35、Cl的性質(zhì)，將其從細(xì)胞勻漿中分離出來(lái)，用飽和苯酚等溶劑與上述核蛋白共振，冰凍離心。 DNA溶于上層水相中，變性蛋白留在酚層內(nèi)。在水相加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，將其沉淀出來(lái)，再以核酸酶水解以除去RNA。最后借助密度梯度平衡超速離心法或?qū)游鲋?，分離DNA。,DNA的分離,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,68,DNA的精制：制得的DNA中還含少量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，將它溶解在蒸餾水中，加入陰離子

36、去污劑硫酸十二酯鈉進(jìn)一步作用于DNA和蛋白，使蛋白質(zhì)與核酸分離而沉淀，通過(guò)高速離心去掉蛋白質(zhì)，在上層DNA溶液加入95%乙醇沉淀DNA，經(jīng)過(guò)乙醇重復(fù)洗幾次，可得DNA精制品。,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,69,核蛋白的提取：將細(xì)胞破碎制成勻漿，再用0.14mol /L NaCl溶液將細(xì)胞質(zhì)的核糖核蛋白體抽提出來(lái)，留下含DNA的細(xì)胞核組織，核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。

37、核酸和蛋白質(zhì)的分離：含水的酚能沉淀蛋白質(zhì)，核酸和多糖則溶于水層。水層中的RNA和多糖可被乙醇沉淀，將沉淀再溶于磷酸鹽緩沖液，然后用?-甲氧乙醇抽提RNA，用乙醇沉淀得RNA。,RNA的分離,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,70,RNA的精制： 在粗制的RNA中加入磷酸鹽，醋酸鹽，乙二醇甲醚并攪拌，使多糖類物質(zhì)溶于水里，RNA溶于乙二醇甲醚內(nèi)，靜置分層。從上層乙二醇甲醚取出加醋酸鈉，用十

38、六烷基三甲基溴化胺鹽使 RNA 沉淀，經(jīng)離心分離得RNA。,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,71,將試劑用濃硫酸或過(guò)氯酸消化，使核酸磷轉(zhuǎn)化成為無(wú)機(jī)磷酸。磷酸能與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸銨，它在還原劑存在下，可被還原生成鉬藍(lán)，再通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷酸測(cè)定核酸。通常RNA平均含磷9.4%,而DNA含磷9.9% 。這樣可從含磷量推算出核酸的含磷量。,定磷法,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以

39、致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,72,利用核酸組分嘌呤環(huán)、嘧啶環(huán)具有紫外吸收的特性，在260nm下，每ml含1µg DNA的消光值(O.D.260)為0.020，每ml含1ug RNA的消光值為 0.022，由未知溶液的消光值可計(jì)算出其中核酸含量。,紫外線吸收法,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,73,RNA與濃硫酸共熱會(huì)降解，生成的核糖進(jìn)而轉(zhuǎn)化為糖糠，它與地衣酚在C

40、uCl2或FeCl3催化下反應(yīng)呈鮮綠色，在670nm處呈現(xiàn)最大光吸收。DNA經(jīng)加熱酸解后，水解所得的脫氧核糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?羥-γ-酮戊醛，再與二苯胺生成藍(lán)色物質(zhì)。在595nm處呈現(xiàn)最大光吸收。RNA和DNA在20~200µg/ml濃度時(shí)，光密度與核酸的濃度呈正比。,定糖法,上頁(yè) 下頁(yè) 章首 節(jié)首,不積蹞步，無(wú)以致千里；不積小流，無(wú)以成江海 友友情分享,74,,為保持核酸的生物活性，分離、分析必須在溫和條件下進(jìn)行，防止過(guò)酸