轉(zhuǎn)染步驟及經(jīng)驗(yàn)(精華)

1、轉(zhuǎn)染步驟及經(jīng)驗(yàn)（精華）轉(zhuǎn)染步驟及經(jīng)驗(yàn)（精華）一、基礎(chǔ)理論一、基礎(chǔ)理論轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。分類：物理介導(dǎo)方法：電穿孔法、顯微注射和基因槍；化學(xué)介導(dǎo)方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性

2、很低的優(yōu)勢(shì)。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。需要指出的一點(diǎn)，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)（見后文）。二、轉(zhuǎn)染操作流程（以常用的二、轉(zhuǎn)染操作流程（以常用的6孔板為例）孔板為例）(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板，以3x1

3、04cm2密度鋪板，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～90%匯合。(不同細(xì)胞略有不同，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的條件進(jìn)行，匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。(2)轉(zhuǎn)染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋110μgDNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋對(duì)應(yīng)量的轉(zhuǎn)染試劑，終量100μL；輕輕混合A、B液（1:1混勻），室溫中置15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染。(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：

4、用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入2mL不含血清及PS的培養(yǎng)液。(4)轉(zhuǎn)染：把AB復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中（緩慢滴加），輕輕搖勻，37℃溫箱置6～8小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。三、轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)三、轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)1.血清A.DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。B一般細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒問題，轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中

5、加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。C.對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基OPTIMEMⅠ培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE2000。無血清培養(yǎng)基OPTIMEM(GIBICO)很好用，有條件的話，就用它代替PBS洗細(xì)胞兩遍，注意洗的時(shí)候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害，細(xì)胞又損失一部分，加

6、了脂質(zhì)體后，細(xì)胞受影響就更大了，死亡細(xì)胞會(huì)增多。2.抗生素（PS）抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GEI

7、CIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無血gal），結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步驟，可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。8.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（APH或ne）可以合成APH酶，通過磷酸化使藥物失活，從而提供對(duì)GECIN選擇性抗生素（G418Sulfate）的抗性。抗生素抗性基因可以與目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如

8、果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染，兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對(duì)于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。陽離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會(huì)提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，使用LIPOFECTAMINEPLUS試劑得到的NIH3T3細(xì)胞GEICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨(dú)使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍（圖17）。

9、要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞，低密度鋪板，給予生長(zhǎng)空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GEICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待4872小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后4872小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GEICIN抗生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GEICIN抗生素的最佳濃度，包括細(xì)胞類型

10、，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定最佳濃度（參見第7章實(shí)驗(yàn)步驟）。篩選最多可能需要一周時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉EICIN抗生素存在條件下，細(xì)胞會(huì)分裂12次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢苑謩e純化（克?。占M(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。9.蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細(xì)菌，真

11、菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)，迅速地合成小量蛋白。常用的細(xì)胞系包括CHO，293和COS7。Invitrogen提供克隆的293F，293H，COS7和CHOS細(xì)胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長(zhǎng)到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持

12、可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適合您應(yīng)用的一種。在