病原微生物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用.pdf

1、病原菌檢測(cè)是關(guān)系到食品衛(wèi)生、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域的重要研究方向之一。檢測(cè)手段的創(chuàng)新能夠迅速推動(dòng)這些領(lǐng)域的發(fā)展。本文介紹了三種基于DNA水平的病原體檢測(cè)方法的研究,其中一種和臨床診斷相關(guān),另外兩種和海洋環(huán)境病原菌污染監(jiān)測(cè)有關(guān)。這三種方法分別是:1)豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法研究;2)沿岸海水中毒性創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)檢測(cè)技術(shù)的研究;3)沿岸海水中致病菌污染的檢

2、測(cè)方法研究。
　　 1)豚鼠氣單胞菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法研究
　　 近些年來(lái),有關(guān)于豚鼠氣單胞菌的感染病例報(bào)道越來(lái)越多,并逐漸引起人們的重視。豚鼠氣單胞菌主要在病人,尤其是兒童的糞便中分離到。目前從糞便中檢測(cè)豚鼠氣單胞菌的常規(guī)方法是選擇性培養(yǎng)和生化鑒定。這些方法需要約3～5天的時(shí)間,因此難以及時(shí)給出診斷結(jié)果。用分子生物學(xué)方法檢測(cè)豚鼠氣單胞菌無(wú)疑是更好的選擇。在本研究中,針對(duì)16S-23S rRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)(16S-

3、23S rRNA internal transcribed spacer,ITS)序列,本學(xué)位論文研究設(shè)計(jì)和驗(yàn)證了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal applification,LAMP)檢測(cè)豚鼠氣單胞菌的方法,并同時(shí)設(shè)計(jì)了一個(gè)特異性PCR檢測(cè)方法作為L(zhǎng)AMP法的對(duì)照。結(jié)果表明,該LAMP檢測(cè)法特異性好、靈敏度高,和PCR方法相比,操作更簡(jiǎn)單,檢測(cè)時(shí)間更短,并且對(duì)設(shè)備要求低,適合于推廣應(yīng)用。
　　

4、 2)沿岸海水中毒性創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)技術(shù)的研究
　　 創(chuàng)傷弧菌是一種條件致病菌,廣泛分布于河灣、沿岸海水中。它能夠引起胃腸道疾病、敗血癥和傷口感染等病癥,給沿岸居民、游客和海事工作者造成健康威脅。然而,并不是所有的創(chuàng)傷弧菌菌株都具有致病性。而目前已發(fā)表的從海水中檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法中,都沒(méi)有對(duì)創(chuàng)傷弧菌的毒性進(jìn)行區(qū)分。本研究建立了兩種用于檢測(cè)毒性創(chuàng)傷弧菌的方法。一種是基于vvhA基因和viuB基因的DNA微陣列雜交法,另一種是基于創(chuàng)傷

5、弧菌毒性相關(guān)基因(vcgC)的LAMP擴(kuò)增方法。此外,我們分別用了60個(gè)和30個(gè)海水樣本對(duì)這兩種方法進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果表明這兩種方法準(zhǔn)確、靈敏、特異性好,適合用于海水中毒性創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)。
　　 3)沿岸海水中致病菌污染的檢測(cè)方法研究
　　 隨著我國(guó)漁業(yè)、海水養(yǎng)殖和海濱旅游等海洋相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,海水污染越來(lái)越受到關(guān)注。而病原微生物污染是海水污染的重要方面。海水中的微生物污染的一個(gè)重要特點(diǎn)是來(lái)源、種類復(fù)雜多樣復(fù)雜。DNA微陣

6、列能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原菌,解析度高,并且操作方便,快速,適合于海水病原菌污染監(jiān)測(cè)的要求。
　　 在本研究中,針對(duì)多種致病菌的16S-23S rRNA基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了特異基因探針,并整合成一個(gè)檢測(cè)這些病原菌的微陣列固定于尼龍膜上。使用一對(duì)通用引物用于PCR擴(kuò)增這些病菌的ITS序列,并使地高辛摻入擴(kuò)增產(chǎn)物,與DNA微陣列雜交,這一方法能夠同時(shí)檢測(cè)海水中自然存在的致病菌以及地表污染輸入的指標(biāo)菌。這些菌包括霍亂弧菌(Vibi

7、o cholerae)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolvticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、金黃色葡萄球菌(Stap

8、hylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、李斯特菌(Listeria spp.)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、沙門氏菌(Salmonella spp.)等。在樣本處理上,采用了過(guò)濾富集法代替培養(yǎng)增菌,增加了檢測(cè)的可靠性。因?yàn)槟壳笆褂玫暮Ｋ≡鷻z測(cè)方法中,都需要培養(yǎng)增菌這一步驟,然而在低溫季節(jié),許多指標(biāo)菌都處于“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài),往往會(huì)導(dǎo)致培