細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展

1、中國組織工程研究第21卷第4期2017–02–08出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchFebruary82017Vol.21No.4ISSN20954344CN211581RCODEN:ZLKHAH621綜述www.CRTER.g王琎，女，1989年生，漢族，河南省人，碩士。通訊作者：陳建英，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三區(qū)，廣東省湛江市524001中圖分類號:R394

2、.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:20954344(2017)040062106稿件接受：20161126WangJinMasterGraduateSchoolofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChinaCrespondingauth:ChenJianyingChiefphysicianMaster’ssupervisThirdDepartmentofCar

3、diologyAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展王琎1，陳建英2(1廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東省湛江市524001；2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)三區(qū)，廣東省湛江市524001)引用本文：王琎，陳建英.細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展[J].中國組織工程研究，2017，21(4):621626.DOI:

4、10.3969j.issn.20954344.2017.04.022CID:0000000344943898(王琎)文章快速閱讀：文題釋義：細(xì)胞外囊泡：是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，是細(xì)胞自發(fā)或在一定條件下釋放出的一種亞細(xì)胞成份，實(shí)質(zhì)上是一組納米級顆粒，近年來學(xué)界研究的熱點(diǎn)，包括外泌體、膜微粒及微囊泡等。自噬：這是發(fā)生在細(xì)胞代謝過程以清除代謝廢物或維持細(xì)胞器更新的一種現(xiàn)象，其過程如下：首先細(xì)胞的一些成分將部分細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞

5、內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分包裹起來形成自噬體，接著自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，目前研究發(fā)現(xiàn)自噬在機(jī)體的生理和病理過程中均能見到。摘要背景：細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生的一種亞細(xì)胞成分，近年來學(xué)界研究的熱點(diǎn)——外泌體、膜微粒及微囊泡等均在其范疇。目的：就細(xì)胞外囊泡定義分類、形成釋放過程、分離鑒定方法、生物學(xué)意義及其在臨床疾病和生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用等方面的最新進(jìn)展作一綜述。方法：由第一作者在PubMed、CNKI

6、等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，關(guān)鍵詞為”ExtracellularVesicles，exosome，microvesicle，microparticle”及“細(xì)胞外囊泡、外泌體、微囊泡、膜微?！薄z索時(shí)間為2006年7月至2016年8月。結(jié)果與結(jié)論：共納入44篇文獻(xiàn)。幾乎所有的細(xì)胞都能產(chǎn)生細(xì)胞外囊泡，其中含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸(DNA、mRNA及micrNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA)等多種母細(xì)胞來源的生物活性成

7、份，這些信息物質(zhì)包裹在囊泡中或攜帶于膜上。他們參與炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞間信號通訊、細(xì)胞存活與凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等，在生理狀態(tài)維持及疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。特定類型的細(xì)胞外囊泡有望成為輔助疾病診斷及預(yù)后判斷的新分子標(biāo)記物；在抗腫瘤治療、再生醫(yī)學(xué)、免疫調(diào)節(jié)等方面也有著廣闊前景；能為干細(xì)胞治療非細(xì)胞途徑開辟新路徑；有可能作為疫苗或藥物的天然載體為臨床治療帶來福音。細(xì)胞外囊泡分泌的分子機(jī)制及其作用于靶細(xì)胞引起生物學(xué)功能變化的具體成分

8、及其信號通路尚在研究中，以研究miRNA者為主，近年來lncRNA、circRNA開始成為新星逐漸走進(jìn)學(xué)者視野。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；細(xì)胞外囊泡；外泌體；組織再生；自噬；藥物載體；非編碼RNA；免疫炎癥；國家自然科學(xué)基金主題詞：組織工程；外泌體；再生；自噬；藥物載體基金資助：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370242)ResearchprogressofextracellularvesiclesWangJin1ChenJianyi

9、ng2(1GraduateSchoolofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina2ThirdDepartmentofCardiologyAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversityZhanjiang524001GuangdongProvinceChina)AbstractBACKGROUND:Extra

10、cellularvesicles(EVs)areakindofsubcellularcomponentproducedbyparacinemechanismincludingexosomesmicroparticlesmicrovesicleswhichhavebecomehotspotsinrecentyears.OBJECTIVE:ToreviewtheresearchstatusprogressofEVsespeciallyint

11、hestudiesaboutdefinitionsecretingmechanismisolationidentificationbiologicalacteristicsfunctionsindiseasesaswellasinbiomedicalresearch.METHODS:ThefirstauthretrievedPubMedCNKIdatabasesfrelativearticlespublishedfromJuly2006

12、toAugust2016.Thekeywdswere“extracellularvesiclesexosomemicrovesiclemicroparticle”inEnglishChineserespectively.細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)意義：概念及一般生物學(xué)特性分離提取及鑒定方法在生物醫(yī)學(xué)研究中的意義細(xì)胞外囊泡文獻(xiàn)檢索綜述分析近年相關(guān)研究進(jìn)展王琎，等.細(xì)胞外囊泡研究新進(jìn)展ISSN20954344CN211581RCODEN:ZLKHA

13、H623www.CRTER.g胞活化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化、放射損傷、細(xì)胞死亡和(或)凋亡等[16]，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)低氧或低營養(yǎng)誘導(dǎo)后會分泌釋放細(xì)胞外囊泡[17]。細(xì)胞外囊泡形成、釋放的分子機(jī)制不完全清楚，可能與細(xì)胞膜重構(gòu)和細(xì)胞骨架改變有關(guān)。既往蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片分析及RTPCR等顯示細(xì)胞外囊泡選擇性地將母細(xì)胞來源的多種生物活性物質(zhì)包裝進(jìn)其雙分子層膜結(jié)構(gòu)中或攜帶于膜表面，如脂質(zhì)(如富含膽固醇和鞘磷)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長因

14、子、特異性及非特異性蛋白、DNA、mRNA、micrNA、lncRNA、circRNA等[14，1821]。外泌體：分子直徑30100nm，也有很多學(xué)者認(rèn)為在150nm范圍內(nèi)的，來源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷的初級核內(nèi)體的微粒都屬于外泌體，這類囊泡在細(xì)胞內(nèi)部形成，與一般的出芽方式不同。其形成釋放過程是，母細(xì)胞釋放顆粒物質(zhì)到質(zhì)膜內(nèi)陷形成的核內(nèi)體腔內(nèi)囊泡中，含有腔內(nèi)囊泡的核內(nèi)體成為次級核內(nèi)體，也稱作多囊泡胞內(nèi)體或多泡小體。隨后，多泡小體離開溶酶體途徑而

15、與母細(xì)胞胞膜特定部位融合，之后胞內(nèi)體中的微小囊泡朝向內(nèi)體囊腔的內(nèi)部形成芽泡，繼而母細(xì)胞將這種芽泡以外泌的形式釋放到細(xì)胞外。由于外泌體特殊的分泌方式，其所含蛋白組分有別于其他細(xì)胞外囊泡，不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，而高表達(dá)與主要組織相容性復(fù)合體以及整合素等多種蛋白質(zhì)相互作用的四分子交聯(lián)體超蛋白家族，如CD9，CD81，CD63以及熱休克蛋白，如熱休克蛋白60，70，90和部分細(xì)胞內(nèi)源性蛋白如Alix，Tsg101等，低表達(dá)磷脂酰絲氨酸。微囊泡

16、：分子直徑1001000nm，也有文獻(xiàn)稱之為脫落囊泡或Ectosomes。形成過程相對簡單，是直接通過出芽方式從母細(xì)胞膜表面脫落產(chǎn)生，大小不均一，高表達(dá)磷脂酰絲氨酸，沒有特定的表面分子標(biāo)記物，但和外泌體一樣表達(dá)母細(xì)胞來源的表面標(biāo)記物[22]。如EMV表達(dá)CD31，PMV表達(dá)CD42b，白細(xì)胞來源的表達(dá)CD45，網(wǎng)織紅細(xì)胞來源的表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子，抗原呈遞細(xì)胞來源的富含MHCⅠ，Ⅱ。微囊泡中也含有如金屬蛋白酶等外泌體中不包含的一些物質(zhì)。

17、凋亡小體：是細(xì)胞程序性死亡或凋亡晚期釋放的微粒，文章不贅述，這類囊泡顆粒較大，分子直徑為5004000nm，具有AnnexinV高親和力，富含死細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)碎片的濃縮DNA，能將這些DNA運(yùn)載入巨噬細(xì)胞細(xì)胞核中。2.3細(xì)胞外囊泡分離提取和鑒定方法目前，學(xué)界普遍認(rèn)同差速離心法是提取細(xì)胞外囊泡的標(biāo)準(zhǔn)方法[23]。先低速離心去除死亡的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，再高速離心去除可溶性蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集體及其他與細(xì)胞外囊泡共沉淀的雜質(zhì)，即可分離得到微

18、囊泡和外泌體。對細(xì)胞外囊泡純度要求較高時(shí)可采用密度梯度離心或免疫磁珠分選的方法來純化細(xì)胞外囊泡。前者是在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。免疫磁珠分選技術(shù)則是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與細(xì)胞外囊泡孵育后結(jié)合，這樣就能將特定的細(xì)胞外囊泡分選出來。此外，分離提取細(xì)胞外囊泡的方法還有諸如微孔過濾技術(shù)、微流控技術(shù)、高效液相色譜法以及細(xì)胞外囊泡提取試劑盒。隨著研究的深入，目前

19、對細(xì)胞外囊泡也進(jìn)行蛋白、DNARNA提取，有學(xué)者使用傳統(tǒng)方法提取，也有研究者用BioVision等公司的提取試劑盒，總的來說各種技術(shù)各有利弊。關(guān)于細(xì)胞外囊泡的鑒定，已有許多技術(shù)能表征以及分析納米顆粒和納米囊泡。其中包括：蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附分析、動態(tài)光散射、透射電鏡檢查法、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)。蛋白免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)是對細(xì)胞外囊泡中蛋白進(jìn)行分析，流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)能分析細(xì)胞外囊泡攜帶的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物；透射電

20、鏡檢查法技術(shù)可以分析細(xì)胞外囊泡分子直徑和形態(tài)結(jié)構(gòu)；納米顆粒跟蹤分析技術(shù)可實(shí)時(shí)地對低濃度的細(xì)胞外囊泡懸浮液中501000nm直徑范圍內(nèi)特定的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行分子波峰及濃度測定。2.4細(xì)胞外囊泡生物學(xué)功能2.4.1細(xì)胞外囊泡所攜帶信息物質(zhì)目前Vesiclepedia中記錄了來自33種不同種類的538份研究統(tǒng)計(jì)分析出細(xì)胞外囊泡中含有92897種蛋白，27642種mRNAs，4934種miRNAs和584種脂質(zhì)等(數(shù)據(jù)是在2015年9月前收錄)[

21、24]。蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白包括血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、MAPK通路信號分子、RHO通路信號分子、Tie2TEK及細(xì)胞黏附分子等。這些蛋白質(zhì)分子部分是酶類，酶催化具有高效性，能夠放大其效應(yīng)，相比RNA，進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)能夠即時(shí)迅速發(fā)揮作用，在維持血管新生以及維持血管功能及修復(fù)損傷組織等方面起主要作用。Ratajczak等[25]證實(shí)小鼠胚胎干細(xì)胞來源的MVs能把蛋白質(zhì)和mRN