設(shè)計(jì)引物如何設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)

1、經(jīng)常有戰(zhàn)友對(duì)一些常見問(wèn)題在丁香園反復(fù)問(wèn)答了很多遍，所以希望園子中一些戰(zhàn)友，特別是低分與0分戰(zhàn)友，能將好的帖子歸納總結(jié)了一下，并結(jié)合自己的經(jīng)驗(yàn)整理，一方面這是個(gè)學(xué)習(xí)提高的過(guò)程，另一方面也能幫助大家解決這方面的問(wèn)題。同時(shí)如有不當(dāng)或不完善的地方，希望各位戰(zhàn)友不斷補(bǔ)充，爭(zhēng)取有朝一日我們能把園子里戰(zhàn)友的經(jīng)驗(yàn)系統(tǒng)整理，給大家以幫助。我先把設(shè)計(jì)引物如何設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)這方面的帖子整理一下，因?yàn)樽蛱煲幌伦涌吹饺齻€(gè)相似問(wèn)題。原帖如下：我想向你求教一個(gè)問(wèn)題假如

2、說(shuō)我想把胰島素基因和腺病毒載體連接起來(lái)如何確定設(shè)計(jì)目的基因PCR時(shí)的引物呢和相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶呢謝謝老師能給予講解謝謝[整理]：最初的時(shí)候，由于害怕設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)最后切不開，所以經(jīng)常采用最通用的方法，用T載體克隆解決問(wèn)題，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)她也有問(wèn)題，就是濃度提不上去，你需要體大量的載體來(lái)酶切，所以感到還是直接擴(kuò)增好一點(diǎn)。但這就需要你仔細(xì)設(shè)計(jì)引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進(jìn)行酶切和連接，當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進(jìn)行PCR擴(kuò)增出靶基因的時(shí)候

3、在核酸的兩端接入酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是與你的質(zhì)粒的特點(diǎn)相關(guān)的，可以在質(zhì)粒的圖譜說(shuō)明書上找取相應(yīng)的位點(diǎn)，進(jìn)行設(shè)計(jì)。（一）設(shè)計(jì)引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個(gè)部分對(duì)片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用（二）設(shè)計(jì)引物所要考慮的問(wèn)題兩個(gè)位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能

4、切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)。我看promega的說(shuō)明書上說(shuō)，最好隔四個(gè)。還有一種情況是：不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來(lái)的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。最好使用酶切效率高的。關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對(duì)值，如果小于10，一般是問(wèn)題的。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫

5、度，一般是沒有問(wèn)題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對(duì)值較大，如果PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過(guò)盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)椋粋€(gè)特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們?cè)谠O(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長(zhǎng)度有關(guān)，比正常的引物(20bp)的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身

6、的部分序列，就可以有效地減少引物的長(zhǎng)度。還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5‘端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對(duì)，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A。（容易錯(cuò)配）引物3’端最佳堿基的選擇是G和C

7、，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。酶切位點(diǎn)都需要保護(hù)堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點(diǎn)前加保護(hù)堿基1，兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上3個(gè)堿基，在做載體構(gòu)建的時(shí)候設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段進(jìn)行定向連接，除了酶切位點(diǎn)，還要在兩端加一個(gè)三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列，否則PCR產(chǎn)物很難被酶切，因此就會(huì)導(dǎo)致連