大型真菌分離與保存技術(shù)

1、大型真菌分離與保存技術(shù)這里的大型真菌主要是指蕈菌，通常說(shuō)的食用菌這塊或蘑菇。(一)、菌種分離及保藏菌種分離是對(duì)真菌菌絲的純化過(guò)程，是把蘑菇菌絲從自然界中單獨(dú)分離出來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)，從而獲得純蘑菇菌絲生長(zhǎng)的菌種。蘑菇菌種的分離方法有三種：即孢子分離、組織分離和基質(zhì)菌絲分離法。1.孢子分離法蘑菇孢子分離法，是利用成熟子實(shí)體的有性擔(dān)孢子能自動(dòng)從子實(shí)體層中彈射出來(lái)的特征，在無(wú)菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上，使孢子萌發(fā)成菌絲，獲得純種的一種方法。孢子分離可

2、分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔(dān)孢子（是指其細(xì)胞核已經(jīng)地核配過(guò)程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來(lái)保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應(yīng)用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個(gè)步驟，首先是采集孢子，其次進(jìn)行單孢或多孢子分離。（1）采集孢子采集孢子首先要選好的子實(shí)體。一般選用個(gè)體健壯，特征典型的子實(shí)體，將選好的子實(shí)體采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用無(wú)菌濾紙把表

3、面水吸干，或直接用75%酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進(jìn)行表面消毒。隨后用無(wú)菌刀切掉多余菌柄（約留下1.52cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無(wú)菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩。這套孢子收集裝置需事先進(jìn)行高壓滅菌消毒。把裝好子實(shí)體的孢子彈射收集器放在溫度為1520C的室內(nèi)經(jīng)2448小時(shí)左右，可見(jiàn)到無(wú)菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。在無(wú)菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無(wú)菌的空試管中，并進(jìn)行真空干燥，之后放入冰箱

4、可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。在野外時(shí)，可用火燒紅消毒的刀切割一小塊組織，用硅酮粘在培養(yǎng)皿蓋子內(nèi)面上讓孢子彈射到培養(yǎng)基上。2.孢子分離多孢分離法：即把多個(gè)孢子接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長(zhǎng)交錯(cuò)在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個(gè)孢子間的種性互補(bǔ)，基本上可25C恒溫箱中培養(yǎng)。挑選單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過(guò)５天的培養(yǎng)開(kāi)始萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過(guò)顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個(gè)孢子萌發(fā)成長(zhǎng)而成的，可使用打孔器進(jìn)行打孔把該菌落移接至新鮮的

5、PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。打孔器的外徑應(yīng)小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會(huì)觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。（２）毛細(xì)管法：孢子懸浮液經(jīng)過(guò)稀釋，使用毛細(xì)滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi)，晝使每一滴只含有一個(gè)孢子，從而達(dá)到單孢子分離，其方法如下：孢子懸浮液制備同稀釋分離法，孢子濃度控制在200300個(gè)孢子毫升。毛細(xì)滴管制備:取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細(xì)管稍冷卻后再加熱并迅速

6、拉長(zhǎng)使管尖內(nèi)徑約200微米剪斷即成毛細(xì)滴管在滴管后端塞棉花裝入消毒盒中后進(jìn)行滅菌備用。點(diǎn)樣鏡檢：用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴)在無(wú)菌操作下快速點(diǎn)于皿蓋內(nèi)壁的標(biāo)記圈中央滴液應(yīng)小于低倍鏡的視野點(diǎn)樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴確定是單孢者即在皿蓋上標(biāo)上記號(hào)。培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約22毫米方塊)推貼至標(biāo)記為單孢子的液滴使液滴中的孢子能夠吸

7、附到培養(yǎng)基邊緣。將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個(gè)皿蓋對(duì)接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣)這樣就形成一個(gè)刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室置培養(yǎng)箱中24C下培養(yǎng)待單孢子萌發(fā)及時(shí)撕下膠布用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊移接到新鮮PDA斜面試管中置24C恒溫箱中培養(yǎng)即可區(qū)得單孢純種。（３）器械分離法：應(yīng)用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至PDA平板中進(jìn)