southern northern western雜交應(yīng)用

1、分子雜交分子雜交分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其分子量大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為Southern雜交、Nthern雜交和Western雜交，以及由此而簡化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交等。一、一、SouthernSouthernblottingblotting1轉(zhuǎn)膜當(dāng)目標(biāo)DNA經(jīng)過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳以后，在0.4NNaOH堿性條件下變性，再在

2、1.5MNaCl1MTris（pH7.4）條件下中和使DNA仍保持單鏈狀態(tài)。然后通過毛細(xì)管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過80℃處理或紫外線照射將DNA固定在濾膜上。圖42是通過毛細(xì)管滲吸法進(jìn)行Southernblotting的經(jīng)典裝置圖。2分子雜交2.1預(yù)雜交將結(jié)合了DNA分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行預(yù)雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜

3、本身對探針的吸附。2.2雜交在一定的溶液條件和溫度下，將標(biāo)記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。2.3洗膜經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去。3檢測3.1放射性標(biāo)記、檢測在分子克隆操作中用于標(biāo)記核酸分子的標(biāo)記物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在摻入核苷酸的標(biāo)記過程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用α位磷酸被標(biāo)記的三磷酸核

4、苷酸，如[α32P]dATP。而在標(biāo)記5末端磷酸基團(tuán)的反應(yīng)中一般使用γ位磷酸被標(biāo)記的ATP。放射性的信號通過X光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。有53外切活性。通過在待標(biāo)記的DNA分子上產(chǎn)生切口，該酶引發(fā)53外切反應(yīng)，在隨后的53DNA聚合反應(yīng)中若存在標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸（dNTP），新合成的核酸鏈就帶有標(biāo)記物。在整個標(biāo)記反應(yīng)體系中，待標(biāo)記的DNA分子的任何一條鏈中的任何位點(diǎn)（除靠近5端外）都可能作為標(biāo)記反應(yīng)的起始點(diǎn)，并持續(xù)到該鏈的3末端

5、。因此，新合成的被標(biāo)記的分子可以代表該待標(biāo)記的DNA分子的絕大部分核苷酸序列。4.1.2隨機(jī)引物標(biāo)記利用由6個核苷酸組成的序列隨機(jī)的寡核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下對目標(biāo)DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增。這樣擴(kuò)增出來的DNA產(chǎn)物包括從任意某個位點(diǎn)（可能最靠近5的一些核苷酸除外）起始的單鏈DNA片段，其整體應(yīng)該包含了目標(biāo)DNA所有核苷酸序列信息。在擴(kuò)增中加入標(biāo)記的dNTP，擴(kuò)增出來的DNA產(chǎn)物就可用作探針。該方法多用來標(biāo)記一個DNA片段。4.1

6、.3PCR擴(kuò)增標(biāo)記在PCR擴(kuò)增時加入標(biāo)記的dNTP，不僅能對探針DNA進(jìn)行標(biāo)記還可進(jìn)行大量擴(kuò)增，尤其適合于探針DNA濃度很低的情形。4.2單鏈探針4.2.1單鏈DNA探針單鏈DNA探針是通過單鏈模板來制備的。首先將待標(biāo)記的雙鏈DNA連接到M13噬菌體載體或噬菌粒載體上，制備其單鏈DNA然后以單鏈DNA為模板，以對應(yīng)于載體上插入位點(diǎn)兩端序列之一的通用引物為引物，在有標(biāo)記的dNTP存在下，通過KlenowDNA聚合酶合成單鏈DNA。經(jīng)過分離

7、純化后即可得到高質(zhì)量的帶標(biāo)記的單鏈DNA探針。4.2.2單鏈RNA探針在有些質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)兩端帶有噬菌體的啟動子，例如pGEM3和pBlueⅡ系列載體分別含有T7SP6噬菌體啟動子和T7T3噬菌體啟動子。將待標(biāo)記的DNA片段插入載體的多克隆位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄區(qū)下游選擇一個酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶將載體線性化以防止轉(zhuǎn)錄出載體的序列和多聯(lián)體產(chǎn)物。加入對應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶，rNTP和某個標(biāo)記的rNTP在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，合成出標(biāo)記的單鏈RNA

8、。利用無RNA酶活性的DNA酶處理以及后續(xù)純化步驟可獲得純化的單鏈RNA探針。單鏈RNA探針的制備不僅比單鏈DNA探針更容易，而且其產(chǎn)生的雜交信號更強(qiáng)。4.3末端標(biāo)記直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加入標(biāo)記的原子或復(fù)合物，這種直接標(biāo)記一般是在探針分子的末端進(jìn)行標(biāo)記，亦稱末端標(biāo)。4.3.1DNA片段的末端標(biāo)記末端標(biāo)記主要通過酶促反應(yīng)來完成，但標(biāo)記的方式很多。如KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合