pet表達(dá)載體

1、表達(dá)載體表達(dá)載體pETA.pET系統(tǒng)是有史以來在系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號(hào)控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50%以上。盡管該系統(tǒng)極

2、為強(qiáng)大，卻仍能很容易地通過降低誘導(dǎo)物的濃度來削弱蛋白表達(dá)。降低表達(dá)水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分產(chǎn)量。該系統(tǒng)的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是在非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的可能毒性造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定(詳見I.F.部分)。如果用非表達(dá)型宿主細(xì)胞克隆，可以通過兩種方法啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)：用帶有受λpL和pI啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶的λCE6噬菌體侵

3、染宿主細(xì)胞，或者將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表達(dá)型細(xì)胞。在第二種情形下，可以通過在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入IPTG來啟動(dòng)表達(dá)。盡管有時(shí)(例如非毒性目的蛋白)可以直接將目的基因克隆到表達(dá)型宿主細(xì)胞中，但這種策略并不是通用做法。兩種T7啟動(dòng)子以及多種擁有不同抑制本底表達(dá)水平的宿主細(xì)胞共同構(gòu)成了一個(gè)極為靈活而有效的系統(tǒng)，使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達(dá)。所有pET載體以及相關(guān)產(chǎn)品均以試劑盒形式提供，用戶可以很方便地進(jìn)行克隆、表

4、達(dá)檢測以及純化目的蛋白的所有操作。pET表達(dá)系統(tǒng)包括質(zhì)粒和宿主菌。您可參考系統(tǒng)組成部分，選擇符合具體需要的載體宿主菌最佳組合。B.使用許可及協(xié)議使用許可及協(xié)議Novagen的T7表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、噬菌體和帶有T7RNA聚合酶基因的質(zhì)粒，均依照非商業(yè)用戶應(yīng)用聲明相應(yīng)條款有條件提供。詳情請(qǐng)垂詢。C.系統(tǒng)組成系統(tǒng)組成pET表達(dá)系統(tǒng)提供目的基因克隆和表達(dá)所需的核心試劑。選定的pET載體DNA，10g宿主菌BL21，BL21(DE3)以及BL2

5、1(DE3)pLysS甘油菌12?目的蛋白的應(yīng)用?目的蛋白已知特定信息?克隆策略pET載體的應(yīng)用多種多樣。例如分析級(jí)表達(dá)量的蛋白用于活性分析，篩選及確定突變，篩選配體相互作用，制備抗原等。大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究，作為試劑或制備親和基質(zhì)?？赡苡卸喾N載體都能滿足表達(dá)用于篩查或抗原制備所需的分析級(jí)表達(dá)量的要求，但是，能用于大量純化的載體宿主菌培養(yǎng)條件的最佳組合條件往往是唯一的。如果要連續(xù)生產(chǎn)大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索載體宿主菌

6、培養(yǎng)條件的組合以便找到最佳條件，是非常值得的。任何有關(guān)目的蛋白的信息都有助于選擇合適的載體。例如，有些蛋白表現(xiàn)活性要求一端或兩端均無外源序列。大多數(shù)pET載體可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻譯起始序列在E.coli中不能被有效使用，表達(dá)水平也會(huì)受到一定的影響。在這種情況下，通常是構(gòu)建一種帶有高效表達(dá)的氨基末端序列的融合蛋白(參見pET載體特點(diǎn)總表，第7頁，N端融合表達(dá))，并在純化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。不需連接反應(yīng)的克隆(

7、LIC)在這種情況中特別有用，可以通過腸激酶或Xa因子切去所有載體編碼的氨基末端序列(參見pET載體特點(diǎn)總表，第7頁)。不同的克隆策略、對(duì)限制性酶切位點(diǎn)及閱讀框的不同要求，會(huì)影響對(duì)載體的選擇。許多pET載體具有同樣的限制性酶切位點(diǎn)，用戶可以僅準(zhǔn)備一次目的插入片段，將其插入到多個(gè)載體中。不同的要求可以考慮采用不同的PCR克隆策略。LIC載體試劑盒是一種非常有用的產(chǎn)品，可以用來以PCR制備插入片段卻避免了限制性酶切消化載體和插入序列的操作。

8、蛋白溶解性及細(xì)胞定位蛋白溶解性及細(xì)胞定位一旦確定了用途和克隆策略，下一步就是判斷目的蛋白在細(xì)胞中的定位和可溶性。許多后續(xù)應(yīng)用要求目的蛋白以具有生物活性的可溶狀態(tài)表達(dá)。而目的蛋白的可溶性常常受很多因素影響，包括特定的蛋白序列等。在大多數(shù)情況下，可溶性并非有或無的現(xiàn)象，載體、宿主菌及培養(yǎng)基的不同選擇可以增加或降低可溶不溶蛋白的量。正確選用合適的載體和宿主菌組合會(huì)明顯提高目的蛋白可溶部分比例及活性。載體可以通過三種方式改善目的蛋白的溶解性或正