生理生化試驗(yàn)

1、熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用孫沖南京林業(yè)大學(xué)森環(huán)學(xué)院江蘇南京210037[摘要]熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的核酸定量技術(shù)，與常規(guī)的PCR相比，熒光定量PCR具有檢測(cè)靈敏，精確，特異性強(qiáng)，無(wú)污染，快速等特點(diǎn)。自問(wèn)世以來(lái)在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。在植物研究方面應(yīng)用較少?，F(xiàn)已開(kāi)始用于植物基因表達(dá)分析、外源基因基因鑒定等方面的研究。本文介紹了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、試驗(yàn)方法、優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其在

2、植物研究中的應(yīng)用及前景作了探討。[關(guān)鍵詞]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)；原理；植物；檢測(cè)；應(yīng)用；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是1985年開(kāi)始出現(xiàn)的一項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù)。由于PCR技術(shù)簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，成為分子生物學(xué)必不可少的研究工具。由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)存在，不能準(zhǔn)確定量，且操作過(guò)程中易污染而使得假陽(yáng)性率高等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到局限。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR基

3、礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)等技術(shù)融合在一起的一項(xiàng)創(chuàng)造性技術(shù)。自產(chǎn)生以來(lái)，在醫(yī)學(xué)、檢疫、國(guó)防軍事及農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)帶來(lái)了方法學(xué)上的重要突破，在植物學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的概念及基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RealtimefluescentquantitativePCR，RealtimeQPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)

4、監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)別是DNA結(jié)合染料法、水解探針?lè)ā㈦s交探針?lè)?、熒光引物法。但在植物中常用的檢測(cè)模式主要有兩種：熒光染料檢測(cè)和熒光水解探針檢測(cè)。3.1雙鏈DNA結(jié)合染料SYBRGreenI技術(shù)SYBRGreenI是一種替代溴化乙錠能結(jié)合到dsDNA小溝部位的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料

5、，它只有與dsDNA結(jié)合后才會(huì)發(fā)出熒光。當(dāng)DNA解鏈成為單鏈時(shí)，它從鏈上釋放出來(lái)，這時(shí)熒光信號(hào)急劇減落。因此，熒光強(qiáng)度可以代表擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。其最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA后，熒光強(qiáng)度大大增加，具有較強(qiáng)的敏感性，且不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，操作簡(jiǎn)便，且價(jià)格相對(duì)較低，故廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)定量PCR研究中。但由于SYBRGreenI非特異結(jié)合雙鏈DNA，引

6、物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)升高溫度后測(cè)量熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由溶解曲線分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量結(jié)果。此外，設(shè)計(jì)引物時(shí)避免引物二聚體的出現(xiàn)，在PCR過(guò)程中建立不加模板的陰性對(duì)照，在試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行凝膠電泳分析等方法的實(shí)施可以有效保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.2熒光探針檢測(cè)技術(shù)根據(jù)標(biāo)記基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluescenceresonan