鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對生長期小鼠體液免疫應答的影響及其機制研究.pdf

1、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP）是一種產(chǎn)耗量大、應用廣泛、危害性強的鄰苯二甲酸酯類化合物，它已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的環(huán)境持久性有機污染物。人類可以通過飲食飲水、空氣塵埃、皮膚吸收和醫(yī)療暴露等多種途徑接觸到DEHP，其中經(jīng)消化道暴露是主要方式，并且兒童表現(xiàn)出對DEHP更高的易感性。流行病學調(diào)查資料提示長期DEHP暴露與現(xiàn)階段支氣管哮喘、過敏性鼻炎和特應性皮炎等疾病在遺

2、傳背景相對穩(wěn)定的同一地區(qū)人群尤其是兒童中持續(xù)高發(fā)密切相關(guān)。已知體液免疫失調(diào)是這類 IgE介導的過敏性疾病的致病基礎。濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cell, Tfh）是新近確認的輔助B細胞介導體液免疫應答的重要Th細胞亞群，其分化紊亂和功能異常會破壞機體內(nèi)環(huán)境的免疫平衡。Tfh細胞可以通過自身表達的免疫調(diào)節(jié)受體來應對外界刺激。細胞核表面或細胞漿內(nèi)的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome prol

3、iferator-actived receptor-γ, PPAR-γ）能夠與相應配體發(fā)生選擇性結(jié)合，繼而進入細胞核對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達進行調(diào)控。已有研究表明 DEHP亦是一種核激素受體調(diào)節(jié)因子，其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可與PPAR-γ識別結(jié)合并相互作用，由此介導產(chǎn)生全身或局部毒效應。鑒于此，我們著眼于Tfh細胞這個新的切入點，探討環(huán)境污染物DEHP對生長期小鼠體液免疫應答的影響及其具體作用機制。
　　實驗方法設計如下：（1）選擇初

4、斷乳BALB/c小鼠作為研究對象，給予動物經(jīng)口灌胃低、中、高劑量的DEHP溶液，同時經(jīng)足墊皮下注射OVA致敏，建立生長期小鼠DEHP消化道暴露模型，采用ELISA法檢測血清中OVA特異性IgE和IgG1類抗體的分泌量，免疫熒光組織化學法觀察淋巴小結(jié)生發(fā)中心的形成，流式細胞術(shù)分析外周淋巴器官Tfh細胞和漿細胞的分化數(shù)量。（2）依次將DEHP暴露和正常小鼠Tfh細胞或非Tfh細胞與B細胞進行T、B細胞兩兩混合，經(jīng)尾靜脈注射過繼性輸入先天性T

5、、B淋巴細胞數(shù)量與功能明顯缺陷的SCID小鼠體內(nèi)，OVA致敏后采用ELISA法檢測血清中OVA特異性IgE和IgG1類抗體的分泌量。隨后，進一步分析 DEHP灌胃染毒對生長期 BALB/c小鼠外周淋巴器官 Tfh細胞核受體PPAR-γ表達、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與細胞因子分泌功能的影響，采用實時定量 RT-PCR與Western Blot檢測Tfh細胞核受體PPAR-γ、特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf的表達水平，流式細胞術(shù)分析Tfh細胞核轉(zhuǎn)

6、錄因子表達以及胞內(nèi)細胞因子IL-21和IL-4的合成水平。（3）針對Tfh細胞建立DEHP體外暴露聯(lián)合干預模型，分析在阻斷或激動PPAR-γ時，DEHP對Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、表面分子表達以及細胞因子分泌功能的影響，采用實時定量RT-PCR與Western Blot檢測Tfh細胞特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf的表達水平，流式細胞術(shù)分析Tfh細胞膜表面標志物與核轉(zhuǎn)錄因子的表達水平，ELISA法檢測 Tfh細胞培養(yǎng)上清液中特征性細胞

7、因子 IL-21和IL-4的分泌量。
　　實驗結(jié)果顯示：（1）DEHP胃腸道暴露能夠以類似佐劑樣毒性作用促進 OVA致敏的生長期小鼠血清中特異性IgE和IgG1類抗體分泌增多，外周淋巴器官生發(fā)中心擴增，其內(nèi) CD4+CXCR5+ICOS+/CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細胞和CD19+CD138+GL-7+漿細胞分化增加。（2）正常小鼠 Tfh細胞與 B細胞混合過繼輸注重建了基礎水平特異性 IgE和 IgG1類抗體的誘導產(chǎn)生

8、；且 DEHP暴露小鼠Tfh細胞無論是與正常小鼠或DEHP暴露小鼠B細胞混合過繼性輸入時，都能促進受體小鼠血清中OVA特異性IgE和IgG1分泌升高；而DEHP暴露小鼠B細胞與正常小鼠Tfh細胞混合過繼輸注則不能提高抗體含量。DEHP胃腸道暴露能夠以佐劑樣作用促進 OVA致敏原誘導生長期小鼠外周淋巴器官 Tfh細胞的核受體PPAR-γ以及特定核轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf表達增加，胞內(nèi)細胞因子IL-21和IL-4合成增多。（3）DEH

9、P體外暴露能夠上調(diào)Tfh細胞相關(guān)分子包括核轉(zhuǎn)錄因子、膜表面標志物以及細胞因子的表達水平；當在DEHP暴露組的培養(yǎng)體系中加入PPAR-γ阻斷劑時，Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf以及表面分子CXCR5、ICOS和PD-1表達降低，細胞因子IL-21和IL-4分泌減少；當添加PPAR-γ激動劑時，Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和c-Maf表達量以及細胞因子IL-4分泌量進一步升高。
　　綜上所述，我們可以得出以下結(jié)論：（1）DE

10、HP胃腸道暴露能夠以類似佐劑樣毒性作用引起OVA致敏的生長期小鼠體液免疫應答失調(diào)，促進生發(fā)中心擴增、漿細胞分化增加以及速發(fā)型超敏反應相關(guān)抗體產(chǎn)生增多。（2）DEHP對OVA致敏小鼠體液免疫應答的干擾作用直接起因于Tfh細胞。DEHP胃腸道暴露能以佐劑樣作用促進致敏原誘導生長期小鼠外周淋巴器官中初始Th細胞向Tfh細胞分化過度，Tfh細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞因子分泌功能紊亂，其輔助B細胞介導的體液免疫應答失調(diào)。（3）Tfh細胞中PPAR-γ可能