天冬酰胺酶在醫(yī)藥中的應(yīng)用

1、XXXXXXXXXXX,L-天冬酰胺酶 在醫(yī)藥中的應(yīng)用,酶在醫(yī)藥方面主要的應(yīng)用,1 用酶進(jìn)行疾病的診斷2 用酶進(jìn)行疾病的治療3 用酶制造各種藥物,藥用藥用酶的一般要求酶的一般要求,1 在機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件下具有較高活力和穩(wěn)定性；2 對底物有較高親和力,不受產(chǎn)物和體液中正常成分抑制；3 在體內(nèi)有較長的半衰期，可緩慢地被分解或排出體外；4 不需要外源性輔助因子；5 在生理?xiàng)l件下酶促反應(yīng)不可逆；6 酶制劑純度高，

2、不含其它毒性雜志，來自非致病性酶源。,,酶在疾病治療方面的應(yīng)用,對治療白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶是第一種用于治療癌癥的酶。 當(dāng)L-天冬酰胺酶注射進(jìn)入人體后，人體正常細(xì)胞內(nèi)由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白質(zhì)合成不受影響。而對于缺乏天冬酰胺合成酶的癌細(xì)胞來說，由于本身不能合成L-天冬酰胺，外來的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此蛋白質(zhì)合成受阻，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。

3、 注射天冬酰胺酶時(shí)，可能出現(xiàn)過敏反應(yīng)，偶爾還可能出現(xiàn)過敏性休克，但停藥后，這些副作用會消失。故此，在注射L-天冬酰胺酶之前，應(yīng)做皮試。在一般情況下，注射該酶可能出現(xiàn)的過敏性反應(yīng)包括發(fā)熱、惡心、嘔吐、體重下降等。對比起可怕的白血病來，這些副作用是輕微的痛苦，在未找到其他更好的治療方法之前是可以接受的。,概述：L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥的應(yīng)用,中文名稱： L-天冬酰胺英文名稱： L-Asparagine 分子式： C4H8N2O3 線

4、性分子式： H2NCOCH2CH(NH2)CO2H 分子量： 132.12,,L-天冬酰胺酶,1．性質(zhì) L-天冬酰胺酶（L-asparaginase , L-ASP ），廣泛存在于微生物、植物和部分嚙齒類動物的血清中，為白色結(jié)晶粉末，微有濕性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有機(jī)溶劑。 對熱穩(wěn)定性好，在溫度50℃下，15min后，活性降低30%，60℃下，1小時(shí)內(nèi)失活。凍干品在2~

5、5℃可穩(wěn)定數(shù)月，但其溶液只能保存數(shù)日，20℃儲存7天，5℃儲存14天均不減少酶的活力。最適宜在pH值為8.5，溫度在37℃下儲存。 純酶的分子量從130000到140000不等。,2．用途 L-天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，為抗腫瘤酶制劑。腫瘤細(xì)胞不能合成生長必需的天冬酰胺而使其生長受到限制。正常細(xì)胞能合成天冬酰胺，故受影響較少。 因此，天冬酰胺酶是一種對腫瘤細(xì)胞有選擇性的抑制藥物。對急性淋巴細(xì)

6、胞白血病的緩解率在50%以上，對急性粒細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞白血病有一定療效，缺點(diǎn)是單獨(dú)使用不僅緩解期短，切易產(chǎn)生耐藥性。該藥對肌體免疫也有抑制作用，它還可用于治療皮肌炎。在動物實(shí)驗(yàn)中，本品對實(shí)體瘤和白血病均有效，且與常見巰嘌呤、甲蝶呤、長春新堿、阿糖胞苷等無交叉耐藥現(xiàn)象。,3．生產(chǎn)工藝過程 L-天冬酰胺酶是用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的酶制劑，其工藝過程如下： 在每一步的生產(chǎn)過程中特別要注意控制好溫度、

7、時(shí)間和溶液的酸堿值，以保證菌種培養(yǎng)和發(fā)酵等過程的適宜條件。,抗腫瘤制劑L-天冬酰胺酶及在治療白血病中的研究,1、白血病介紹2、 L-天冬酰胺酶臨床應(yīng)用3、 L-天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)與功能4 、L-天冬酰胺酶的純化與修飾5、 L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥上的進(jìn)展,目錄,1.1概述 白血?。↙eukemia）是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病?？寺≈械陌籽〖?xì)胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻。1.2特征 白細(xì)胞

8、呈惡性、無限制地增生，浸潤全身各組織和臟器，周圍血液血細(xì)胞有量和質(zhì)的變化。抑制紅細(xì)胞和血小板止血的產(chǎn)生，非常容易受傷、出血、感染。,1、白血病介紹,1.3分類 臨床上分為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、急性非淋巴細(xì)胞白血病（ANLL）、慢性粒細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病。1.4死亡率 慢淋白血病發(fā)病在50歲以后，才明顯增多 急性白血病若不經(jīng)特殊治療，其平均生存期可能只有三個(gè)月左右。,2、L-天冬酰胺酶的

9、臨床應(yīng)用,L-天冬酰胺酶（L-asparaginase, L-ASP，EC.3.5.1.1），商品名為左旋門冬酰胺酶，目前在臨床上已經(jīng)被用于急性淋巴細(xì)胞白血?。╟hildhood Actute lymphoblastic leukemia, ALL）的治療。L-ASP單獨(dú)使用時(shí)，對ALL的有效率為60%，與長春堿（vincristine）及皮質(zhì)甾類藥物（corticosteroids）聯(lián)合使用時(shí)，對ALL的有效率高達(dá)95%。

10、 另外，L-ASP對單細(xì)胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性網(wǎng)狀皮層組織增多癥以及慢性髓細(xì)胞白血病也有一定的療效，對胰腺癌細(xì)胞的增多還有一定的抑制作用，是臨床治療白血病的重要物質(zhì)。,3、L-天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)與功能,3、L-天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)與功能,3、L-天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)與功能,L-ASP結(jié)構(gòu)中與催化活性相關(guān)位點(diǎn)的研究 L-ASP用于臨床以來，人們對其分子結(jié)構(gòu)與催化活性間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究。L-ASP結(jié)果中已經(jīng)被研究過的位點(diǎn)包括T12、

11、Y25、S58、T89、N248等，L-ASP的活性中心由T12、Y25、S58、T89、D90。,L-天冬酰胺酶的作用機(jī)制,L-ASP抗腫瘤的作用機(jī)制在于它能降低人體內(nèi)L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的濃度，這兩種氨基酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細(xì)胞缺乏天冬氨酰合成酶，不能合成L-天冬酰胺，需要攝取外源L-天冬酰胺才能存活。當(dāng)外源L-天冬酰胺被分解掉時(shí)，癌細(xì)胞合成核苷酸和戴白騅·蛋白質(zhì)的能力就會顯著降低，因此L-AS

12、P能有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增值。 L-天門冬酰胺是某些腫瘤細(xì)胞生長必不可少的氨基酸，對人體正常細(xì)胞而言 自身具有合成L-天門冬酰胺的能力，而腫瘤細(xì)胞缺乏天門冬酰胺合成酶不能合成天門冬酰胺，其細(xì)胞需要從外源的L-天門冬酰胺攝取才能存活。L-ASP 能催化水解L-天門冬酰胺生成L-天門冬氨酸和氨，因此能夠有效地抑制癌細(xì)胞的生長，最終使癌細(xì)胞消亡。,L-天冬酰胺酶的分離純化,將L-ASP與高效先導(dǎo)序列pelB融合使得L-ASP在

13、細(xì)胞外表達(dá)，并在L-ASP的N末端添加了6個(gè)組氨酸序列標(biāo)簽，然后采用Ni-NTA親和層析法分離純化得到L-ASP，成本高，并不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。 經(jīng)蔗糖破壁、(NH4)2SO4分級沉淀、透析、DEAEDE52、Q Sepharose Fast Flow等步驟純化得到的L-ASP比活力高達(dá)U/mg，SDS-PAGE檢測時(shí)顯示為一條帶，RT-HPLC分析純達(dá)到99%，最終回收率為50.5%，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的要求

14、。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,L-天冬酰胺酶的修飾 L-ASP的聚乙二醇化不但降級了胰蛋白酶對它的降解作用，而且修飾酶的抗原性與天然酶相比也大為下降。 此外，聚乙二醇化L-ASP與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體化L-ASP相比與有明顯的優(yōu)勢。,微囊化修飾 將L-天冬酰胺酶用半透膜性質(zhì)的聚合物制成微囊型固定化酶。其大小一般為1～ 500Lm。 低分子底物可以自

15、由出入膠囊膜, 與酶接觸而起反應(yīng), 反應(yīng)產(chǎn)物則因濃度不斷增加而不斷滲透出膠囊外面。 囊型固定化可以克服天然酶針劑出現(xiàn)的抗體抗原反應(yīng) 該注射到人體后, 對膜具有良好通透性的低分子底物, 能長時(shí)間發(fā)揮作用, 比天然酶的 療效好, 而且急性毒副反應(yīng)也較低。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,用固定化酶反應(yīng)器進(jìn)行體外循環(huán)凈化血液中L -天冬酰胺 方法： 將固定化L -天冬酰胺酶裝填于柱中或?qū)⑵涔潭ㄔ诿赴濉⒚?/p>

16、管或血液透析膜上, 使血液從固定酶上通過, 除去癌細(xì)胞生長所需的L 2天冬酰胺, 從而達(dá)到治療的目的。 改進(jìn)的功能： 由于酶不與體內(nèi)器官直接接觸, 也就不會發(fā)生毒性和過敏反應(yīng)。 具有天然酶的高度專一性及溫和條件下高效催化的特點(diǎn), 還具有一定的機(jī)械強(qiáng)度; 酶經(jīng)固定化后, 穩(wěn)定性有較大的提高, 可以反復(fù)使用也可儲存較長時(shí)間。,4、L-天冬酰胺酶的純化與修飾,1 Erwinase獲準(zhǔn)用于治療對大腸桿菌源性天冬酰胺酶

17、過敏的急性淋巴細(xì)胞性白血病患者,注：Erwinase：歐文氏菌源性的天冬酰胺酶,5、 L-天冬酰胺酶在醫(yī)藥上的進(jìn)展,2011年11月18日，EUSA制藥和美國食品藥品管理局(FDA)宣布孤兒藥Erwinase獲準(zhǔn)用于治療對大腸桿菌源性的天冬酰胺酶有超敏反應(yīng)的急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患者。 Erwinaze是一種可降低循環(huán)血液中天門冬酰胺水平的天冬酰胺酶。天門冬酰胺是細(xì)胞生長的必需氨基酸，將其從血液中清除可抑制ALL相關(guān)

18、細(xì)胞的生長。天冬酰胺酶產(chǎn)品來源于細(xì)菌，近15%~20%的患者可對大腸桿菌源性的現(xiàn)代制劑產(chǎn)生超敏反應(yīng)因而無法持續(xù)治療。Erwinaze是由歐文氏菌產(chǎn)生的，在免疫學(xué)性質(zhì)上有別于原有的制劑，適用于對大腸桿菌源性治療有超敏反應(yīng)的患者。 FDA批準(zhǔn)Erwinase是基于相關(guān)的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果，共涉及630例ALL患者。在一項(xiàng)納入58名受試者的關(guān)鍵性療效研究中，100%的可評估患者達(dá)到了天冬酰胺酶活性主要終點(diǎn)。 Erwina

19、ze的不良反應(yīng)：過敏反應(yīng)、胰腺炎、轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平升高、血栓形成、出血、高血糖癥、惡心和嘔吐。,2 靜脈注射天冬酰胺酶對于55歲左右新診斷急性成淋巴細(xì)胞白血病誘導(dǎo)緩解期治療的藥效動力學(xué)以及安全性,與兒童相比，天冬酰胺酶成人治療的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)以及安全性信息非常有限。研究人員采用單次靜脈注射天門冬酰胺酶(2000 IU/m(2))作為25例成人患者誘導(dǎo)緩解的線藥物，并在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得血清樣本。結(jié)果可見，天門冬酰胺酶活性血清峰濃度的

20、總體均值為1 IU/ml，消除半衰期為7天，分布容積為2.43 L/m(2)。單劑量給藥后，患者2小時(shí)后完全去氨基，并分別在14、21和28天完成100%、81%和44%。 藥效動力學(xué)相關(guān)模型顯示，0.2 IU/ml的最小酶活性最適天門冬酰胺酶消除。動態(tài)的POSTHOC分析顯示酶活性可以持續(xù)3個(gè)星期或更長。1例患者在給藥后22天產(chǎn)生了抗天門冬酰胺酶抗體。天門冬酰胺酶耐受性很好，很少出現(xiàn)3/4級不良反應(yīng)。未觀察到過敏反應(yīng)或胰