中樞神經系統疾病的基因治療

1、中樞神經系統疾病的基因治療,石奕武神經科學研究所廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院,概 述,定義早期是指用正常的基因整合入細胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。,目前廣義上來講是指將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法。,基因治療的概念,基本程序,治療性基因的選擇,基因載體的選擇,回輸體內,,重組表達載體,應用與展望,1）單基因缺陷病2）體細胞的基因治療3）靶細胞可以從病人機體獲

2、取4）治療效果勝過危害5）表達水平無需嚴格調控6）動物實驗證明符合嚴格的安全標準,研究概況1990年，美國批準了人類第一個對遺傳病進行體細胞基因治療的方案，即將腺苷脫氨酶（ADA）導入一個4歲患有嚴重復合免疫缺陷綜合征（SCID）的女孩。采用的是反轉錄病毒介導的間接法，即用含有正常人腺苷脫氨酶基因的反轉錄病毒載體培養(yǎng)患兒的白細胞，并用白細胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，經10天左右再經靜脈輸入患兒。大約1－2月治療一次

3、，8個月后，患兒體內ADA水平達到正常值的25％，未見明顯副作用。此后又進行第2例治療獲得類似的效果。致使世界各國都掀起了基因治療的研究熱潮。,經過十幾年的發(fā)展，基因治療已取得初步的臨床療效，例如2000年法國巴黎內克爾兒童醫(yī)院利用基因治療使11名有免疫缺陷的嬰兒恢復了正常的免疫功能,盡管后來有一名兒童患了白血病,但這仍是近十年來基因治療取得的最大成功。目前每年用于基因治療上的總投資在10億美元左右，主要集中在美國，其次是歐

4、洲。到2001年底全世界已批準了600個基因治療臨床試驗方案，其中針對癌癥治療的方案居首位，有378個方案，占總數的63.1%；其次是針對單基因疾病、心血管病、傳染性疾?。ㄖ饕荋IV）、基因標記和其他疾病治療方案。,神經系統疾病的防治--人們面臨的巨大挑戰(zhàn)大多數炎癥、營養(yǎng)缺乏性疾病及良性腫瘤等，通過傳統的藥物、手術和飲食療法可以治愈相當多的疾患不能治愈--帕金森病、亨廷頓病等有一些疾病至今仍無防治方法，如阿爾茨海默病

5、及惡性腫瘤等全新的治療概念──中樞神經系統(CNS)的基因治療(gene therapy),一、中樞神經系統基因治療概述,存在著一定的困難:①CNS被嚴密的骨質系統所包裹,使得一些重要的物理操作相對難以進行；②完整的血腦屏障(BBB)的存在是向腦內導入基因轉移載體的天然屏障；,③神經系統功能的分子機制及其疾病的分子遺傳學變化最近才緩慢地得到了初步的認識,因此,能夠通過基因修飾而得到治療的神經系統疾病較少;④對于某些CN

6、S代謝性疾病(如溶酶體蓄積病),在出生之前就已經在細胞內有大量毒性物質的堆積,提示必需在胚胎期就進行治療才有可能取得滿意的療效;,⑤神經系統由多種功能不同并且高度分化的細胞組成,細胞之間存在著不同的、復雜的甚至是變化著的聯系,不同的神經元和膠質細胞之間在結構上和功能上可能存在著相當大的差異,因此,神經系統遠比其它器官都要復雜;,⑥神經細胞或膠質細胞均很難大量分離以用于原代培養(yǎng)和遺傳修飾。對成熟神經元和/或膠質細胞進行遺傳

7、修飾并有效地進行腦內移植的技術方法還未完全成熟。,隨著近年來基因治療的技術方法上的進展, 初步結果顯示基因治療在CNS疾病的治療中也具有廣闊的應用前景。其原因在于:①隨著定位克隆和疾病相關基因的分離和鑒定技術的發(fā)展,越來越多的神經系統疾病的遺傳學病因得到了澄清;,②隨著對疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制了解的深入,目前已經確認的基因治療方法不僅適用于有明確基因改變的遺傳性疾病,而且也適用于非遺傳性疾病的治療;,③ 可以使用非神經

8、細胞或非膠質細胞(如自體成纖維細胞或成肌細胞)作為遺傳修飾細胞; ④ 最近發(fā)現有些藥物可造成BBB的一過性滲透性損傷,從而使大分子物質甚至基因轉移載體進入腦內;,⑤已成功地構建了一些新型的、能夠感染非分裂期終分化細胞(如神經元)的病毒基因轉移載體(如復制缺陷型重組腺病毒、皰疹病毒及腺病毒相關病毒等),從而使向成熟神經元和/或膠質細胞內直接進行基因轉移成為可能。,（一）中樞神經系統基因治療的分類,根據靶細胞分類生殖細胞

9、(germ cell)基因治療:將受精卵或早期胚胎細胞做為治療目標進行生殖細胞的基因治療是可行的；受精卵或早期胚胎細胞的遺傳改變勢必影響后代，倫理學障礙和技術上的困難使生殖細胞基因治療目前仍為禁區(qū)。,體細胞(somatic cell)基因治療：體細胞基因治療只涉及體細胞的遺傳轉變，不影響下一代，現已被廣泛接受做為CNS嚴重疾病的治療方法之一，在現代倫理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。,根據基因轉移

10、的途徑in vivo (活體直接轉移，或稱一步法)：指將含外源基因的重組病毒、脂質體或裸露的DNA直接導入CNS內；操作簡便、容易推廣。尚不成熟，存在療效短、免疫排斥及安全性等問題基因轉移研究的方向，只有in vivo基因轉移方法成熟了，基因治療才能真正走向臨床。,指外源基因克隆至一個合適的載體，首先導入體外培養(yǎng)的自體或異體(有特定條件)的細胞，經篩選后將能表達外源基因的受體細胞重新輸回受試者CNS內, 實質上就是遺

11、傳修飾細胞的腦移植。經典、安全、而且效果較易控制，但是步驟多、技術復雜、難度大、不容易推廣。,ex vivo(離體轉移或稱二步法),（二）中樞神經系統基因治療的策略根據宿主CNS病變的不同，CNS基因治療的策略也不同，概括起來主要有下列四種：1、基因替代(gene replacement) 指去除整個變異基因，用有功能的正?；蛉《?，使致病基因得到永久的更正。優(yōu)點：遺傳性疾病等的最理想的方法缺點：難以實現,2

12、、基因修正(gene correction) 將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。如基因打靶技術(同源基因重組)的研究進展已表明，哺乳動物細胞基因組確實存在著某些結構和酶學機制，可使外源DNA在特定的部位進行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復成為可能。,3、基因增強(gene augmentation) 將目的基因導入病變細胞或其它細胞，目的基因的表達產物可以補償缺陷細胞的功能或使原有的功能得到加強。近十

13、年來已經發(fā)展了許多有效的方法可將目的基因導入真核細胞，并獲得表達，因而是目前較為成熟的方法。最適宜隱性單基因疾病的治療,4、基因抑制(gene constraint)和/或基因失活(gene inactivation) 導入外源基因去干擾、抑制有害的基因表達。如向腫瘤細胞導入腫瘤抑制基因(如Rb或p53)，以抑制癌基因的表達。,此外利用反義技術(antisense technology)封閉某些特定基因的表達，以達到抑制有害

14、基因表達的目的，已被廣泛用于CNS惡性腫瘤(如膠質母細胞瘤)等的基因治療研究中。,（三）中樞神經系統基因治療的原則必須分離出含有調節(jié)序列的特異性基因；必須能夠獲得足夠數量攜帶該基因的載體或/和細胞；,必須建立一條有效的途徑將該外源基因導入腦內、轉染靶細胞；最后轉染入宿主腦細胞的目的基因必須能產生足夠量的產物，可維持適當長的時間，且不產生有害的副作用。導入CNS內的基因要特異、穩(wěn)定、高效、安全并具有可調控性。,1、目

15、的基因的選擇 ①該基因的異常是疾病發(fā)生的根源；②該基因遺傳的分子機制清楚；③基因已被克隆，一級結構和表達調控機制較為清楚；,④可在體外操作，而且安全有效；⑤轉移基因在受體細胞內最好能夠完整地、穩(wěn)定地整合并能適時適量表達功能性蛋白質。,染色體基因組互補DNA (complementary DNA，cDNA)多數是通過cDNA的克隆化技術得到的?？蓱萌斯ず铣?、PCR技術擴增等途徑獲得目的基因,2、目的基因來源：,

16、目的基因必須置于合適的啟動子的控制之下，編碼基因的信號肽序列(signal sequence)必須完整，只有這樣，目的基因才可獲得適當的表達，基因調控是目前基因治療研究的薄弱環(huán)節(jié)。,其原則為：①最好選擇組織特異性細胞，即外源基因僅在該系統組織中表達，而在其它組織中不表達或表達水平較低；②細胞要易于從體內取出，有增殖趨勢，且生命周期較長，使得有足夠的時間進行體外基因操作；,3、 受體細胞的選擇 --成敗的一個關鍵因素，

17、選擇病變發(fā)生細胞/非病變發(fā)生細胞,③離體的細胞要能接受外源基因的轉染；④細胞經過體外基因操作后能夠存活下來，并能安全輸送回體內；⑤能預設某一安全機制，在必要時可激活以阻止修飾細胞在體內有害的生長和/或有害功能的發(fā)揮，以避免腫瘤發(fā)生。,目前，應用于CNS基因治療研究的靶細胞主要有成纖維細胞、原代骨骼肌細胞、膠質細胞、胚胎中腦細胞、條件永生性神經細胞及神經干細胞。適合于基因轉染及腦內移植的靶細胞最好來自宿主自身的同源細胞，以避免

18、發(fā)生免疫排斥。,膠質細胞優(yōu)勢是能很好地在體外生長與繁殖，移植到腦內靶點后可很好地存活并整合到腦實質中，可獲得長期、穩(wěn)定的轉基因表達，是一種潛在的基因治療細胞載體；其缺陷是植入腦內成瘤的危害性大。,胚胎中腦細胞相對安全，但細胞難于獲得，在體外培養(yǎng)較難，且不易用經典方法行基因轉染。神經干細胞最理想的轉基因靶細胞，因它們在生長因子作用下能夠不斷生長繁殖，且植入腦后也能根據所處環(huán)境分化成相應細胞，并與宿主形成突觸聯系。,4、基因載體的

19、選擇 目的基因本身一般不含有啟動子等調控序列，導入靶細胞后很難得到目的基因的表達。因此，必須將目的基因重組于表達載體的合適位置，再導入細胞，在特定調控序列指導下進行表達。表達載體有質粒載體(plasmid vector)和病毒載體(viral vector)兩大類。,質粒載體一般可用物理的、化學的以及融合法導入靶細胞。包含哺乳動物細胞的表達調控元件，細菌胞漿內進行復制的表達元件，因此被稱為穿梭載體(shuttle vec

20、tor)，意指在哺乳動物細胞和原核生物細胞中均能穩(wěn)定復制、穩(wěn)定存在的基因載體。,目前被廣泛應用于哺乳動物細胞的質粒載體有pSV2，pRSV，pcDNA3和pCI載體系列等?？刹迦胼^大長度的外源基因(～10kb以上)，有較廣泛的宿主細胞范圍，經轉染的細胞不發(fā)生裂解，故可建立穩(wěn)定分泌外源蛋白的細胞株，用于ex vivo基因轉移。,病毒載體的構建原則與質粒載體相似，但進入靶細胞的方式不同。目的基因與病毒載體重組形成重組載體。在

21、基因治療中多是將此重組載體以不同方式進行包裝，獲得重組的病毒顆粒，再感染靶細胞，以便將目的基因帶入靶細胞，并得到目的基因的表達。有多種病毒載體，其特點各異。,病毒載體,（四）中樞神經系統基因轉移的方法和實施途徑CNS基因轉移方法分為物理、化學和生物學三大類。前兩類是非病毒的方法，后一類即生物學方法主要指病毒介導的基因轉移，包括ＲＮＡ病毒，ＤＮＡ病毒兩類。,1、病毒載體介導途徑 即以復制缺陷的重組病毒將靶基因引入體內。

22、許多病毒載體，包括逆轉錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、腺相關病毒、慢病毒及多種雜交型病毒載體等，已應用于CNS基因治療的基礎和臨床研究。作為基因治療的載體，要得到廣泛應用，必須簡單、安全、可靠，且能在宿主體內長期穩(wěn)定表達。,迄今為止，病毒載體用于CNS細胞基因傳遞取得了許多進展，盡管其安全性及效率仍有待提高，但in vivo方法已成為目前CNS基因轉移的主要研究方向，只有in vivo方法取得成功，CNS基因治療才能走向

23、臨床。,重組病毒載體因其自然感染途徑而成為較有效的基因轉移手段，病毒載體用于腦內基因傳遞應具備哪些特點呢？1、插入基因的容量必須足夠因載體內包含了目的基因、特異性調控序列及可誘導的啟動子；,病毒載體的特點,2、腦內基因注射存在容量限制問題，故向特定神經元細胞群轉染目的基因時，載體的轉染效率及滴度必須較高3、轉基因產物的穩(wěn)定表達是必要的，由于啟動子的失活，載體序列的物理喪失，細胞毒性效應及外源蛋白的免疫反應，此目標常常較

24、難實現。,4、轉基因產物表達量的可調控性也是重要的，載體中包含的特異性調控序列對治療控制是必要的。病毒載體具有CNS細胞特異性的靶向性，即病毒載體能通過細胞特異性啟動子、特殊的受體表達或軸漿運輸路線，選擇性地感染某些細胞。病毒載體介導的基因轉移能應用于臨床，無毒性或炎癥性免疫反應是必要的。,2、非病毒介導途徑即通過物理法、化學法或融合法直接將目的基因導入體內。避免重組病毒包裝過程中產生的野生病毒污染和免疫反應，具有

25、安全、操作簡單、插入容量不受限制及可通過物理方法實現靶向性轉移（如基因槍）等優(yōu)點。,直接導入的DNA通常難以整合入基因組，基因表達存在不穩(wěn)定性，且在非分裂細胞中基因的轉染效率不高，使其應用受到限制。,迄今為止，在基因治療研究中所用的非病毒基因轉移法有ＤＮＡ直接注射法，磷酸鈣轉染法、電穿孔法、顆粒轟擊技術、脂質體介導的ＤＮＡ轉移法，受體介導的基因轉移法等。,這些基因轉移方法可以轉移僅由ＤＮＡ組成的載體，并依賴不同機制將大

26、分子物質攝入哺乳動物細胞中，并在細胞內運輸。由此等方法轉移的外源基因的表達是暫時的，因為這些基因不易穩(wěn)定整合到宿主細胞的基因組，而易被細胞內的ＤＮＡ酶降解，并將其排出胞外。,從概念上說，非病毒基因轉移要比病毒基因轉移方法安全。應用這些方法的前提是重組基因在人組織中只需要暫時性表達，這在某些疾病如腦腫瘤的治療中是很有用的，同時這些基因可以象藥物一樣被反復應用。,二、中樞神經系統疾病基因治療的實驗研究,許多實驗動物模型已應

27、用于CNS疾病基因治療研究，包括神經系統遺傳病、神經變性疾病、腦缺血、腦創(chuàng)傷及腦腫瘤等。這些模型均可通過藥物誘導或損傷誘發(fā)，而腦腫瘤模型則可通過體外培養(yǎng)的腫瘤細胞移植動物腦內而產生。,隨著許多神經系統疾病致病基因的明確，應用轉基因小鼠復制具有人類疾病相同遺傳病因的轉基因動物模型已成為現實，這些小鼠模型包括嗜質體酶缺乏癥、視網膜變性綜合征，此外還包括自發(fā)性腦腫瘤和神經變性綜合征等。,（一）遺傳性神經疾病 人類基因

28、治療最早著眼于遺傳性疾病（主要限于單基因遺傳?。?，隨著越來越多CNS遺傳病致病基因的發(fā)現和克隆，應用轉基因小鼠復制具有人類疾病相同遺傳病因的轉基因動物模型也已成為現實，使得遺傳性疾病的基因治療研究變得更加活躍。,1、Huntington病 一種以基底節(jié)和大腦皮層變性為主要病變的常染色體顯性遺傳病，主要臨床特征是慢性進行性發(fā)展的舞蹈樣動作和癡呆。其發(fā)病機制仍不清楚，目前，研究發(fā)現HD與IT15基因的單一型突變有關，導致

29、Huntington蛋白中的多聚谷胺酰胺纖維大量增加，使紋狀體GABA能輸出神經元細胞群對興奮性毒性、氧化應急和線粒體功能障礙的敏感性增加。,幾種HD基因治療方法已分別在DNA、RNA和蛋白水平進行了研究，反義基因治療對這種疾病來說還存在技術上困難，但保護性基因治療方法卻取得了令人鼓舞的結果。后者主要包括移植能分泌保護或替代因子的工程細胞，例如產生NGF的成纖維細胞或神經前體細胞。,幾種神經營養(yǎng)因子，包括BDNF，已被證

30、實有益于紋狀體神經元的存活。Bemelmans等將克隆BDNF基因的Ad注射至Huntington 病模型大鼠的紋狀體中，發(fā)現BDNF的存在能促進紋狀體神經元的存活。,2、杜興氏肌營養(yǎng)不良征,（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性中最常見的X連鎖致死性遺傳病，其特點是包括呼吸肌在內的全身骨骼肌進行性萎縮?，F已證實dystrophin基因（dystrophin gene）的突變或缺失是導致DMD的主

31、要原因。,目前，dystrophin基因已被克隆，dystrophin全長cDNA約為14kb。應用dystrophin基因治療DMD的研究正在進行，Akkaraju等應用第一和第二代復制缺陷型HSV載體，介導全長dystrophin基因轉移至dystrophin缺陷的肌萎縮細胞和轉基因小鼠體內，并觀察到dystrophin在肌萎縮細胞中和小鼠體內的表達，但治療范圍局限于注射部位，因不能得到全身性的治療效果，其應用前景并不樂

32、觀。,Cho等就此問題進一步進行了探索，他們在應用重組Ad介導dystrophin基因轉移取得成功的基礎上，通過改變血管腔內的Starling力和肌纖維成熟度，試圖從血管內途徑給予克隆dystrophin基因的Ad，從而達到全身治療目的。,3、神經退變性疾病：如帕金森病目前有兩種主要策略：①神經遞質合成或代謝酶的基因轉移，可部分增強變性系統的功能。②營養(yǎng)因子或保護蛋白的轉基因可以延緩或阻止進一步的神經變性進程。,①、

33、帕金森病（Parkinson’s disease，PD ） 中老年人常見的中樞神經系統變性疾病之一，主要病理特征為黑質紋狀體系多巴胺能神經元進行性死亡，多巴胺(dopamine, DA)含量顯著減少。臨床表現為靜止性震顫、肌強直、動作減少及平衡障礙。由于其病因和發(fā)病機制尚未明確，目前的所有治療手段，包括藥物治療和各種外科手術只限于癥狀控制，不能從根本延緩或阻止其病程的進展。,70年代后期國內外學者曾嘗試應用腎上腺髓質細

34、胞、胚胎黑質細胞、交感神經節(jié)細胞及復合組織細胞移植治療PD。取得了一些進展，但由于供體細胞來源困難、免疫排斥、植入細胞難以在宿主腦內長期存活等諸多因素，限制了它的臨床應用。,目前對PD治療研究最多、最有前途的方法為基因治療。PD被認為是中樞神經系統疾病基因治療的最佳模型，因為它的病理機制較明確，病變部位局限，變性細胞單一，相關的基因已被克隆，有適當的動物模型，移植的方法也比較成熟。,PD基因治療主要有兩條途徑：通過引入左

35、旋多巴或多巴胺合成酶，提高紋狀體內多巴胺含量；通過引入潛在的神經保護分子，阻止多巴胺神經元進一步死亡，促進受損的黑質紋狀體系統重建和功能恢復。提高腦內多巴胺含量能減輕其臨床癥狀，而阻止多巴胺能神經元死亡，則有可能從根本上治愈該病。,體內多巴胺合成過程中存在兩種催化酶，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和芳香氨基酸脫羧酶（aromatic-amino-acid decarboxylase, A

36、ADC），TH是腦內多巴胺生物合成的限速酶，PD患者TH及TH mRNA的水平明顯低于正常人，而TH mRNA/TH的比值與正常人沒有明顯差異，提示通過腦內補充TH基因，可以促進L-Dopa的生成。,而AADC即使在紋狀體失神經支配情況下，在非多巴胺神經能神經元或膠質細胞中仍充分存在。故治療中只需在紋狀體內表達外源性TH，多巴胺含量即可明顯提高。但TH的活性功能離不開輔助因子BH4的作用，在紋狀體失神經支配時這種輔助因

37、子的水平也下降，TH和BH4合成酶，GTP-cyclohydrolase1的聯合移植，對獲得足夠的L-dopa產物是需要的。,Wolff 等應用逆轉錄病毒載體將TH cDNA 轉染至大鼠的尾狀核，獲得了TH的表達，并使模型動物阿撲嗎啡誘發(fā)的旋轉次數明顯減少。Jiao等將含有TH的表達質粒(pCMVth)在脂質體介導下轉染肌母細胞和肌管細胞(myotube),聯合移植于PD大鼠紋狀體內， 獲得高水平的穩(wěn)定表達(6個月以上)，

38、使阿撲嗎啡誘導的旋轉次數減少了75%。,Anton等將含有TH表達載體的溫度敏感性永生性大鼠神經細胞( 衍生于體外培養(yǎng)的原始中腦胚胎細胞)THB2和LP6細胞混合移植入2只PD猴模型紋狀體內，結果猴的旋轉行為減少了54%，免疫組化確證了TH的存在。,通過對黑質DA能神經元的保護使黑質紋狀體系統得以保存是PD治療最佳目標，既可以延緩PD進程，又可避免L-dopa治療引起的副作用。研究表明應用in vivo或 ex vivo

39、方法將神經營養(yǎng)因子、抗凋亡分子及抗氧化劑等基因分別轉染黑質紋狀體系統后，均能達到神經保護治療目的。,膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）是目前發(fā)現的一種對多巴胺能神經元具有很高的特異性營養(yǎng)活性的神經營養(yǎng)因子，研究表明外源性的GDNF在黑質、紋狀體內的表達可以對多巴胺能神經元產生十分明顯的營養(yǎng)作用。,GDNF基因的有效表達，可以減緩、阻

40、止甚至逆轉多巴胺能神經元的退行性病變過程，從而從根本上遏制PD的漸進性病程。Derek等將編碼GDNF的一種復制缺陷腺病毒載體直接注射到帕金森病大鼠中腦黑質區(qū)，證實DA神經元能免受6-OHDA的損害,近年來細胞凋亡在PD發(fā)病機制中的作用已被認識，自由基、某些神經遞質、神經毒素及神經營養(yǎng)因子缺乏等因素啟動了這一機制，通過細胞自身內部基因調控過程，導致黑質紋狀體系統多巴胺(DA)能神經元發(fā)生凋亡。,在此認識上，采用各種抗細胞

41、凋亡治療措施可保護DA神經元，NTFs已被證實能保護神經元免受凋亡。Clarkson等證實用GDNF在體外培養(yǎng)胚胎大鼠中腦DA神經元，其凋亡發(fā)生率可降低2%～5%。原癌基因bcl-2其多方位的抗凋亡作用機制已較為明確，將其基因克隆后轉染黑質紋狀體系統表達，則可保護DA神經元免受凋亡。,Mattew(1996)等將攜帶bcl-2基因的缺陷型單純皰疹病毒(HSV)載體轉染體外培養(yǎng)的海馬神經元后，證實的bcl-2過度表達能保護

42、神經元免受阿霉素毒性損害，并觀察到其在體內表達時能保護紋狀體神經元免受局部缺血的損害。,AD基因治療的早期策略是向腦內移植遺傳修飾后的能產生NGF的自體同源細胞或神經前體細胞。除了神經營養(yǎng)因子外，還可以通過神經遞質的恢復和替代方法治療AD，膽堿乙酰基轉移酶（choline acetylase,ChA）是腦內乙酰膽堿合成的限速酶，AD患者腦內存在ChA活性下降,乙酰膽堿合成減少。,②、阿爾茨海默病 (Alzheimer‘s

43、Disease ，AD),轉導ChA基因，提高乙酰膽堿合成，可治療AD。最近，Saille等研究發(fā)現，表達人類抗凋亡基因bcl-2的轉基因小鼠皮層神經元，可明顯抵抗β-淀粉樣蛋白的神經毒性損害，提示以抑制神經元凋亡為目的的AD神經保護基因治療具有研究潛力。,是一種發(fā)生于成年人的致命性神經變性疾病，以進行性運動神經元變性為特征。其病因目前還不明確，亦無有效治療方法。現已證實編碼超氧化物歧化酶（superoxide dismu

44、tase，SOD）的基因突變與家族性ALS發(fā)病有關。研究表明各種神經營養(yǎng)因子，如CNTF、GDNF、BDNF、IGF-1等可不同程度保護運動神經元。,4、肌萎縮性側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis ，ALS）,臨床研究發(fā)現這些神經營養(yǎng)因子全身給藥后，不易通過血腦屏障，甚至出現明顯毒性反應（如CNTF），為了安全向ALS病人體內引入這些神經營養(yǎng)因子，基因治療已成為一種主要研究手段。,目前，幾

45、種ALS基因治療方法正在探索：Aebischer等將球囊包裹可分泌CNTF的工程細胞移植到ALS患者腰部鞘內，盡管未取得明顯的治療效果，但可從CSF中檢測到CNTF的水平，且未發(fā)現明顯毒性作用。,Haase等通過肌肉和靜脈內注射Ad介導的CNTF到進行性運動神經元病突變小鼠，可延長其生存期和降低神經元變性，而腦脊液內給藥被證實無效。ΒDNF或GDNF可保護新生鼠運動神經元免受軸突切斷引起的變性損害。,Mohajeri等將

46、逆轉錄病毒介導的GDNF的成肌細胞，注射至6周齡家族性ALS轉基因小鼠后肢肌肉中，18周齡時接受GDNF成肌細胞小鼠較對照組體內存在較高數目的運動神經元。表明產生GDNF的成肌細胞可減慢疾病進展或延緩這種小鼠運動系統病變的進展。,最近，Azzouz等將rAAV介導的抗凋亡基因bcl-2注射至SOD突變轉基因小鼠脊髓內，證實能觀察到bcl-2蛋白在脊髓運動神經元中表達，并能顯著增加疾病晚期運動神經元的數目。,5、腦腫瘤

47、治療CNS腫瘤細胞分型較復雜，主要包括星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、腦膜瘤和垂體瘤等，其中前兩者約占50%。盡管依據現有診療水平CNS惡性腫瘤不難得到確診，但由于其浸潤性生長特性及腫瘤細胞基因的異質性，血液中藥物進入腦內困難和CNS較差的免疫監(jiān)視作用，使得目前的外科治療、藥物及放射治療均不能根治。,通過基因治療手段彌補當前臨床治療的缺陷，增加其效力，拓寬治療范圍，包括增加治療基因或傳遞途徑的范圍，已成為目前CNS基因

48、治療最主要的研究課題。,CNS腫瘤的基因治療，其主要策略包括病毒載體對腫瘤細胞的直接裂解、抗癌藥物的激活、抗血管生成、腫瘤細胞分裂和轉移的抑制、免疫增強和誘導凋亡?？梢詮陌┗?、生長因子及其復合體基因，腫瘤細胞內信號轉導及細胞周期調控因子等幾方面實施治療。,前體藥物的激活一直是腦腫瘤基因治療研究的主要方法。最早用于腦腫瘤轉基因治療研究的是HSV胸腺核苷酸激酶（thymidine kinase，TK）基因，這種酶可以將丙氧

49、鳥苷轉化為一種毒性核苷酸類似物，從而干擾了DNA合成導致腫瘤細胞死亡。,但以下缺陷使其臨床應用受到限制：基因產物本身的抗原性，使表達基因產物的細胞發(fā)生非特異性或分裂前死亡；核苷酸類似物的不擴散性，使其只能在具有縫隙連接的細胞間轉移。,近年來，針對前體藥物激活和抗癌藥物增效的研究策略，其數量在迅速增多。例如，細菌來源的胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）可激活5-氟胞嘧啶，變成5-氟尿嘧啶，后者是一種常用的

50、化療藥，作用類似于丙氧鳥苷。,自殺基因： 某些病毒或細菌產生的酶,,藥物前體,,細胞毒性物質,酶基因(cd),腫瘤細胞,,,,,表達相應的酶類(CD),藥物前體(5-FCyt),,細胞毒性物質(5-Fura),,殺死腫瘤細胞,,6、腦缺血,缺血性腦損害（血流的減慢或出血的毒性）導致的變性表現為神經功能下降和漸進性形態(tài)學改變。腦細胞缺氧時，通過誘導厭氧糖酵解來獲得能量消耗，可引起興奮性氨基酸釋放、Ca2+和Na+過

51、度超載、內環(huán)境穩(wěn)定性改變和自由基損害。增加營養(yǎng)因子、抗凋亡分子和神經遞質等幾種基因治療方法已在研究。,缺血性后神經細胞凋亡機制的證實，使研究者著眼于減慢或阻止這種損害的發(fā)生。在缺血發(fā)生之前或之后，通過HSV增強子載體介導bcl-2基因轉移，可保護神經元免受缺血性損害引起的細胞死亡。應用Ad介導白細胞介素－1受體拮抗劑，能明顯縮小梗塞范圍和降低局部缺血后的炎癥反應。,Ad介導神經元凋亡抑制蛋白（neuronal apopt

52、osis inhibitory protein，NAIP）可縮小大鼠海馬缺血損傷的范圍。應用HSV載體表達72 Kda熱休克蛋白，也可暫時提高局部缺血區(qū)神經元的存活。腺病毒已被證實能有效地介導腦血管及腦膜轉基因，具有血管擴張功能酶的基因轉移能減弱缺血損害，ex vivo缺血治療包括移植NGF基因修飾工程細胞至海馬，保護CA1和CA2區(qū)的神經元免受損害。,7、疼痛,鞘內和腦內病毒載體介導的基因注射是一種有希望的疼痛治療方法

53、。在大鼠模型中，腦脊液中注射一種克隆了內源性阿片肽…β-內啡肽基因的重組腺病毒，可誘導軟腦膜細胞轉染，轉基因細胞可釋放β-內啡肽基因進入腦脊液，使得這種神經肽更容易接近阿片受體，結果可以明顯減輕炎性過敏疼痛。用重組HSV將前腦啡肽基因傳遞至杏仁核，亦可短期內阻止疼痛發(fā)生。,8、 癲癇,隨著癲癇發(fā)病機制中多基因因素的證實，許多探索已開始集中于基因治療。正在研究的方法包括：應用HSV擴增子載體傳遞熱休克蛋白（HSP72），保

54、護海馬神經元免受海藻酸的毒性損害。應用Ad介導谷氨酸脫氫酶基因轉移，增加抑制性神經遞質GABA的合成。應用脂質體介導膽囊收縮素，一種抗驚厥和抗阿片神經肽，腦室內給藥可暫時消除聲源性驚厥發(fā)作。,Gene Therapy,For complex partial seizures: TLEA promising approach for alternative treatment of epileptic patients who

55、 are resistant to conventional AEDs.,vector,Adeno-Associated virus(AAV)Safe: never asssociated with human diseaseStable: efficient, non-immunogenic, nano particle(20 nm) with limited capacity～

56、 5 kbPersist: >99%,Target Gene and Results,AAV 2 containing GABRA4 promotor to drive transgene expression in dentate gyrus(DG) after status epilepticus(SE).Increasing GABRA1 mRNA and protein expression i

57、n DG at 1-2 weeks after SE.,Resulting in a threefold increase in mean seizure-free time after SE and a 60% decrease in the number of rats developing epilepsy(recurrent spontaneous seizures) in the first 4 weeks after SE.

58、,Altering GABR subunit expression can affect the development of epilepsy and suggest that alpha1 subunit levels are important determinants of inhibitory function in hippocampus.,rAAV containing human NPY (neuropeptid

59、e Y) gene injected into rat hippocampus. Long-lasting peptide expression and effectively suppresses acutely induced seizures and delays epileptogenesis in animal models.,Chronic epilepsy with spontaneous seizures(SS) mi

60、micking TLE.4 weeks later, control rats showed a 300% average increase in SS frequency. In the rAAV-NPY groupe,80% of rats did not show progression in SS, and 4 out of 10 showed 50%reduction in SS frequency.,Hippocampal

61、 NPY significantly increasing in rAAV-NPY Rats.Suppresses SS and arrests the underlying disease process and represents a promising new therapeutic strategy.,基因治療在目前是尚不成熟的治療手段。要將神經系統疾病的基因治療從實驗研究過度到臨床應用可能還需要數年時間。目前神經系統

62、疾病進行臨床基因治療研究的只有腦腫瘤。人們不應幻想在一些重大技術難題沒有攻克以前，神經系統的基因治療會在短時間內就會有重大突破。,基因治療目前要解決的幾個主要問題是：尋找更多更有價值的目的基因；深入研究精確調控目的基因表達的機制，組建具有調控序列的基因；構建組織特異性或定向基因表達的載體；,穩(wěn)定地將其轉入有絲分裂后的細胞；克服病毒載體引起的免疫反應等。而CNS基因治療更面臨獨特的問題，如CNS組織的復雜性、細胞種類的多樣性，