結(jié)核病細菌學檢驗的標準化與新診斷技術(shù)進展

1、結(jié)核病細菌學檢驗的標準化與新診斷技術(shù)進展,,強化結(jié)核病實驗室診斷標準化的必要性,1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民（流動人口）2、我國結(jié)核病疫情依然嚴重3、目前結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的不足,分類,結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長和快速生長兩大類。,結(jié)核分枝桿菌特點,結(jié)核菌生長緩慢，在一般

2、培養(yǎng)基上分裂一代需要10-20小時細胞壁厚度為10~35nm，較一般細菌的細胞壁厚，含有大量脂類，具有堅韌性和疏水性?？顾嵝允欠种U菌的重要特征。,結(jié)核病細菌學檢查的重要作用,細菌學檢查是結(jié)核病最客觀、最科學和最重要診斷方法和流行病學研究工具。因此結(jié)核病的實驗室檢驗仍然面臨著較多的問題。,細菌學檢驗存在的問題,不易于標準化操作誤差較大（可達到30%） 1、個人操作誤差 2、標本性狀 3、標本來源對結(jié)果的理

3、解差異可影響檢驗結(jié)果對臨床治療的參考或指導意義。,主要的細菌學檢驗技術(shù),1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實驗技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù),標準的痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù),標本的收集，特別是痰標本的采集、保存制片和染色過程的標準化讀片操作的熟練程度和標準化對結(jié)果的理解,痰標本的采集、保存和運送,膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標本，痰量應為3-5毫升。難以獲得合格標

4、本時，也應進行細菌學檢查，但應注明標本性狀，以供分析結(jié)果時參考。容器上應注明與檢驗單一致的病人姓名、編號及日期。不能及時檢驗的痰標本應置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運，外送前要認真核對檢驗單與痰瓶上標注，放在專用的轉(zhuǎn)運箱內(nèi)運送。,標本的采集,標本留取方法痰標本的留取應在醫(yī)護人員的指導下進行。醫(yī)護人員應告知病人如何咳痰，合格的痰標本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，并說明唾液檢出的可能性很小。檢驗人員檢查痰標本的性狀，并在登記本和檢驗

5、報告單上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記）。,如何正確留痰,查痰對于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應該及時遵醫(yī)囑治療。 送檢痰標本的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果的準確性。請您一定按照下列要求和方法留取合格的痰標本。每個痰盒應分別留取1～2口痰，請不要將1口痰分開放到2或3個痰盒中。正確的咳痰方法： 1、咳嗽前應緩慢地深吸氣，吸氣后稍

6、屏氣片刻。 2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。 3、咳嗽時腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。 4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。 5、重復緩慢吸氣動作或平靜呼吸片刻，準備再次咳嗽的動作。* 注意：部分人如果忽然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動作

7、的連貫性，一氣呵成。同時，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。,直接痰涂片檢查法,萋爾-尼爾遜氏（Ziehl－Neelsen）抗酸染色法 （熱染法）,細菌學常規(guī)檢查 —直接涂片法,操作流程,涂痰膜自然干燥,復紅加熱初染5分鐘,自然干燥鏡檢,流水沖洗,美蘭復染30

8、秒,鹽酸酒精脫色,流水沖洗,流水沖洗,,,,,,,,載玻片,（一）新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后 方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹1份痰標本。（三）載玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復用于AFB檢查。（四）載玻片正面一側(cè)1/3處標注實驗室序號(如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。（五）載玻片正面另一側(cè)2

9、/3中央處均勻涂抹成面積為10×20 mm的卵圓形痰膜。,染色,（一）嚴格按照操作規(guī)范完成染色程序。（二）染色后的痰膜應呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。（三）將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。（四）染色后的痰膜脫落部分應小于整個涂抹面積的10%。,（一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細觀察300以上的視野。（三）每個工作日

10、，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應超過25張。（四）連續(xù)閱讀10～12張玻片后，應休息20分鐘左右。,鏡檢讀片,,痰涂片抗酸菌濃度與陽性結(jié)果機率 檢出菌數(shù) 每毫升標本估算菌數(shù) 陽性結(jié)果機率0/100或更多視野 ＜1000 ＜10％1-2/300視野 5000 - 10000

11、 50％1-9/100視野 約30000 80％1-9/10視野 約50000 90％（cv）1-9/每視野 約100000 96.2％（cv）10或更多/每視野

12、 約500000 99.95％（cv）,,,,查痰次數(shù)與陽性機率關系為什么診斷前強調(diào)三涂兩培（3S 2C） 1 2 3 4 5,,,,,,,,,,,,,,,,,,細菌學常規(guī)檢查 —直接涂片法,顯微鏡檢報告方式：0條/300視野

13、： 萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實報菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽性（+）1-9條/10視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性（2+）1-9條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性（3+）?10條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽性（4+）,細菌學常規(guī)檢查 —直接涂片法,注意事項：選擇痰標本中膿性、血樣、干酪樣的部分涂片陽性率較高；一張玻片只涂

14、一份標本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打開痰盒、涂抹痰膜時容易產(chǎn)生氣溶膠，應注意正確操作和自身防護；石炭酸復紅初染時必須加溫。,細菌學常規(guī)檢查 —直接涂片法,優(yōu)點：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標本，有重要的臨床診斷價值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評價療效的重要指標，有重要的流行病學意義；操作簡便，價格低廉，適于各

15、級實驗室開展；快速，數(shù)小時可報告結(jié)果。,細菌學常規(guī)檢查 —直接涂片法,缺點：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果；特異性較低：只能報告“抗酸菌陽性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。,涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng) —室內(nèi)質(zhì)控,標本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護、結(jié)果的報

16、告和登記、痰片的分類保存等應按照國家參比實驗室的統(tǒng)一標準嚴格進行操作。復查方式：自查：試驗員當日對已查涂片抽樣復查?；ゲ椋河杀緦嶒炇移渌囼瀱T抽查當日10%涂片。,涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)—室間質(zhì)控,以現(xiàn)場和非現(xiàn)場督導為主要方式?，F(xiàn)場督導：質(zhì)控實驗室人員赴被質(zhì)控實驗室就實驗室布局、安全防護、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護狀況、日常實驗記錄等進行考核和指導，并以盲法、按比例抽取涂片復查。非現(xiàn)場督導：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原

17、則抽取涂片交實驗室復查。,復檢玻片樣本量,1.樣本量估算：盲法復檢的關鍵是復檢結(jié)果能否真正代表被督導實驗室的實際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性（針對陰性玻片）、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復檢在統(tǒng)計學意義上可以代表被評估實驗室的總體水平。,復檢樣本量計算表,復檢樣本量計算表說明：,a、玻片陽性率：指所有檢測的玻片中陽性玻片的比例（平均陽性率）。b、上一年陰性玻片總數(shù)

18、：每年玻片的總數(shù)減去全年陽性玻片數(shù)。c、抽樣時，當上一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽性率不在選擇點，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽性率采用區(qū)間下限。,復檢結(jié)果評價,盲法復檢的目的不是為了驗證某個病人診斷正確與否,而是評價整個實驗室操作水平。評價的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標本的質(zhì)量（合格標本與不合格標本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實驗室的工作質(zhì)量。,1.誤差分類：分為定性誤差和定量誤

19、差（1）定性誤差包括高假陽性和高假陰性高假陽性（High False Positive HFP）：陰性片被錯誤地判讀為2＋以上的陽性。高假陰性（High False Negative HFN）：2＋以上的陽性玻片被錯誤地判讀為陰性。,（2）定量誤差包括量化誤差、低假陽性和低假陰性量化誤差（Quantification Error ，QE）：同一張陽性玻片初檢者和復檢者陽性判斷級別的差異。低假陽性（Low False Posit

20、ive ，LFP）：陰性玻片被錯誤地判斷為1＋及以下的陽性。低假陰性（Low False Negative， LFN）：1＋及以下玻片被錯誤地判斷為陰性。,常見“誤差”原因,實驗室診斷的新進展,1、擴大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗2、引入現(xiàn)代分子生物學快速檢測技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學快速檢測技術(shù),1、現(xiàn)代分子生物學檢測主要技術(shù),實時熒光定量PCR環(huán)介導等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal ampli

21、fication， LAMP)分子線性探針（Hain 技術(shù)） (2008WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù),（1.1）聚合酶鏈反應（PCR）,PCR誕生于1985年，由美國 Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復制原理而設計的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應組成一個周期，經(jīng)過n個周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子，使DNA

22、特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。,實時熒光定量PCR,實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應體系加入熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得定量的結(jié)果.即在同一個反應體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測

23、,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復雜的定量檢測工作。,實時熒光定量PCR,該技術(shù)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學發(fā)光技術(shù)檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,（1.2）環(huán)介導等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated iso

24、thermal amplification， LAMP),檢測是連續(xù)等溫進行的。擴增效率十分高，反應靈敏。采用4條引物，識別6個位點，特異性強。不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。反應不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測。利用Bst酶的鏈置換功能進行反應。加入反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。,Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE),LAMP 方法,PURE 方法,等溫

25、反應高擴增效率高特異性實驗周期短(幾乎一個小時),簡單去除核酸擴增抑制因子縮短處理時間,Pre-treatment kit,LAMP test,Sample,Lysis,Mixture,,Filter,,DNA,LAMP 檢測,,陰性,陽性,不需要離心, 等溫, 快速 (整個過程只需一個小時)；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500-100

26、拷貝/毫升）的DNA 或RNA擴增到10微克左右。,LAMP 敏感度,,10,100,1000,NC,copies/reaction,模板: 純化的 TB 基因組DNA反應條件: 67℃, 40min,LAMP結(jié)果分析,儀器特點：1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反應產(chǎn)物的濁度．2.可以設定相應的反應條件與檢測要求．3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進行實時分析． 4.檢測結(jié)果（圖像等）可以打?。?.可同時檢測32個樣本，８聯(lián)管適

27、用．,（1.3）、分子線性探針（Hain 技術(shù)）,原理：基于PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應判斷結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復合群、快速檢測RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性,GenoType® 分支桿菌試劑盒系列,GenoType ® MTBC （來自于培養(yǎng)標本的結(jié)核分枝桿菌復合群菌種間的鑒定）GenoType ® Mycobact

28、eria Direct（來自于病人標本的結(jié)核分枝桿菌復合群，非結(jié)核分枝桿菌復合群的鑒定）GenoType ® Mycobacterium CM（來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType ® Mycobacterium AS（來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType ® MTBDRplus （結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測）GenoType

29、74; MTBDRsl （結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測）,技術(shù)設備,TwinCubator® 手工雜交儀,自動操作-全自動雜交儀,GT-Blot®48 或 GT-Blot® 20,GenoType? MTBDRplus結(jié)果,MTBC及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性,適用于培養(yǎng)物和痰液。 檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測； 檢測INH單耐藥型TB、M

30、DR和XDR； 符合WHO推薦的線性探針分析標準。,GenoType? MTBDRplus/sl – 優(yōu)點,驗證數(shù)據(jù),結(jié)論,DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復合群的區(qū)分和藥敏試驗。所有檢測都采用通用試劑盒和相同的方案進行擴增和雜交。 所有檢測均可在4-5小時內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測（每天檢測數(shù)百份樣品）。,（1.4）、基因芯片技術(shù),科學的發(fā)展人類的進步要求進行大規(guī)模基因信息的解析 鑒于基因芯片的

31、多種用途和其遠大的發(fā)展前景，不少生命科學研究機構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計目前僅國內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計至少有二三十家。它已象半導體技術(shù)一樣成為一個重要的產(chǎn)業(yè)方向。當前已正被廣泛地應用于諸多領域，包括生物醫(yī)學、臨床診斷學和基因組學研究。,什么是基因芯片,基因芯片指對數(shù)以千記的DNA片段同時進行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達譜的檢測等（Trends in B

32、iotechnology)。 該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。,基因芯片技術(shù)的主要特點,技術(shù)操作簡單 自動化程高 序列數(shù)量大 檢測效率高 應用范圍廣 成本相對低,博奧 分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法),主要分為樣品制備、芯片反應和結(jié)果判讀三部分。 首先，將檢測菌的DNA從培養(yǎng)、分離純化的菌株或者

33、直接從臨床樣品中提取出來； 然后，對樣品中的靶基因進行擴增和熒光標記； 接著，將擴增并熒光標記的基因序列與芯片上的探針進行雜交反應； 最后芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀。,芯片掃描結(jié)果 1,,臨床驗證,（1.5）GeneXpert MTB/RIF快速診斷技術(shù),Cepheid® MTB/RIF: 可直接檢測痰液，檢測結(jié)核分支桿菌的同時，鑒定是否有利福平耐藥性， 2小時出結(jié)果。GeneX

34、pert檢測平臺采用實時熒光定量PCR檢測原理。所有檢測均無需提取核酸，手工操作時間不超過2分鐘。,GeneXpert 最大程度簡化TB檢測?。?！,將痰液加入處理瓶，放置15分鐘；將處理后的樣品加入樣品反應盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始”鍵；得到結(jié)果（2小時）：檢測是否含有結(jié)核分支桿菌的同時，可對利福平耐藥性進行判讀。,Xpert MTB/RIF檢測操作步驟,1、痰液加入處理瓶， 放置15分鐘

35、。2、取處理后的痰液 2mL加入Xpert反應 試劑盒3、將反應試劑盒放入 GeneXpert儀器， 點擊“開始”（手工操作至此結(jié)束?。?、自動過濾洗滌樣品5、自動超聲破碎，純化 樣品6、熒光定量PCR擴增7、巢氏PCR擴增8、自動結(jié)果判讀 （MTB/RIF）,“Sample in. Answer out.”,全自動操作 完全封閉系統(tǒng) 污染可能

36、性小 減少人為錯誤 結(jié)果精確度高 檢測時間短,無需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實驗室,研究人數(shù) >1,700 Patients? 秘魯、南非、阿塞拜疆、印度,? 涂片陽性樣品：? 靈敏性98.2%,特異性99.2%? 涂片陰性, 培養(yǎng)陽性樣品：? 三次檢測靈敏性 90.2%? 一次檢測靈敏性72.5% ? 對利福平耐藥性檢測：? 靈敏性97.6%,特異性98.1%,結(jié)論,GeneXpert檢測Mtb簡單、易于操作，對操作

37、者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反應液加入儀器即可得出診斷報告；GeneXpert檢測Mtb快速：整個過程大約2小時。GeneXpert檢測Mtb對操作人員安全：整個檢測過程全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG—176 cfu/ml；H57Rv—112 cfu/ml耐藥性診斷：可對利福平耐藥性進行檢測,現(xiàn)代免疫學診斷技術(shù),1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過檢測抗結(jié)核桿菌的

38、抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)和免疫金標記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標記的滲濾法等，采用的抗原也各不相同。,體液免疫學診斷技術(shù)的意義,在國內(nèi)應用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應用價值。不足之處：單獨使用時，其檢測的特異性和靈敏度都有些缺點。目前國際上反對使用該項技術(shù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問題。,2、細胞免疫學診斷技術(shù),細胞免

39、疫診斷技術(shù)應用較少，過去主要應用PPD皮試技術(shù)，近年來英國和澳大利亞研制了ELISpot 、T-Spot技術(shù)和 QFT-Gold 。此項技術(shù)用于感染情況的檢測是一項特異性較強、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。,酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)技術(shù) 是檢測細胞分泌細胞因子的一種實驗方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性細胞使其產(chǎn)生IFN-?，并檢測IFN-?的濃

40、度變化進行診斷的方法。通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對加底物后形成的斑點分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。,ELISPOT技術(shù)原理,細胞免疫主要由T淋巴細胞發(fā)動，T淋巴細胞分成效應T淋巴細胞和記憶T淋巴細胞。記憶T淋巴細胞在首次感染病原體后長期存在免疫系統(tǒng)中。當再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細胞發(fā)出信號分子并增殖成為效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞分泌細胞因子，如 干擾素(INF-γ )。所以無論是否有臨床癥

41、狀，檢測效應T淋巴細胞在血中的水平可作為機體是否被感染的指標。,ELISPOT在結(jié)核病診斷中的應用,在MTB潛伏感染診斷中的應用早期診斷MTB潛伏感染對控制結(jié)核病意義重大。目前診斷MTB潛伏感染仍沿用100年來使用的 TST，但 TST不能區(qū)分MTB感染患者和接種BCG的健康人以及感染環(huán)境中的分枝桿菌患者。Lalvani在土耳其檢查了暴露于肺結(jié)核家庭環(huán)境中的908名健康兒童。皮試結(jié)果表明580名兒童患有潛伏性肺結(jié)核,需要進行藥物

42、治療,以免轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核;而ELISPOT結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有380名兒童患有潛伏性肺結(jié)核。通過ELISPOT檢測,只需要治療380名兒童,而不是580名,但卻能夠預防同樣數(shù)量的活動性肺結(jié)核病例發(fā)生。因此，ELISPOT 比TST篩選結(jié)核潛伏感染更有效,而且ELISPOT檢測結(jié)果與MTB的接觸程度相關性更強。,ELISPOT早期技術(shù)評估 英國Ewer等用ELISpot檢測對結(jié)核分枝桿菌分泌的抗原有特異性反應的T淋巴細胞來診斷早期

43、結(jié)核病。這項研究共納入了結(jié)核流行區(qū)有不同程度結(jié)核病接觸史的535名學生，結(jié)果顯示結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)和ELISpot的一致性達89%(P<0.0001)。但ELISpot與研究對象結(jié)核病接觸程度之間的正相關性顯著強于TST。在接種過BCG的兒童中，TST假陽性的可能性較大，而BCG接種對ELISpot結(jié)果沒有影響。作者認為ELISpot可開始替代TST，這將使更多的人能在感染仍處于隱匿期時就可進行預防，而不至于發(fā)展成為嚴重的

44、結(jié)核病。,ELISPOT法的優(yōu)點,(1)靈敏、特異，能從100萬個細胞中測出1個分泌INF細胞；只有MTB和少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌才會出現(xiàn)陽性反應，而BCG及多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能區(qū)別BCG接種出現(xiàn)的陽性反應。 (2)快速：能早期診斷結(jié)核感染，檢測全過程2天。 (3)應用面廣：在肺結(jié)核、肺外結(jié)核及免疫抑制的結(jié)核患者均能檢測。 (4)療效評估：當結(jié)核菌被消滅后，效應T淋巴細

45、胞即消失，測定效應T淋巴細胞也可檢測機體是否清除了結(jié)核菌，進行臨床療效評估 。,ELISPOT技術(shù)的缺點,細胞培養(yǎng)及抗原刺激時,有發(fā)生細菌污染的可能,以致實驗失敗; 實驗過程步驟較多,實驗人員需有一定的理論基礎并經(jīng)多次操作的培訓方能勝任; 目前試劑價格比較昂貴。,結(jié)束語,結(jié)核病準確、快速的診斷是結(jié)核病防治人員多年期盼的。隨著科技不斷進步，今天企盼已經(jīng)成為可能。經(jīng)過不斷的對現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)化和繼續(xù)努力開發(fā)更新的技術(shù)，相信未來的結(jié)核病實