2.1《微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)》新新

1、課題1：微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),微生物,：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．,微生物包含了除植物界和動(dòng)物界以外的所有生物,病毒：DNA病毒（T2噬菌體）、RNA病毒（SARS、煙草花葉 HIV、流感）,原核生物：細(xì)菌、放線菌、衣原體、支原體、藍(lán)藻,真核生物：（酵母菌、霉菌、食用菌）,原生生物：單細(xì)胞動(dòng)植物（草履蟲、單細(xì)胞藻類）,病毒,,酵母菌,放線菌,霉 菌,細(xì) 菌,上圖都是一些常見的微生物，微生物是結(jié)

2、構(gòu)簡單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，與人類關(guān)系密切。人工的培養(yǎng)和分離，使得我們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)微生物。,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。,有些細(xì)菌（多為桿菌）在一定條件下，細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體。每一細(xì)胞僅形成一個(gè)芽孢，所以其沒有繁殖功能。,1.芽孢,脫離親本后能直接或間接發(fā)育成新個(gè)體的生殖細(xì)胞。它是有絲分裂

3、或減數(shù)分裂的產(chǎn)物；,2. 孢子,3. 菌落,菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）：人們按照微生物對(duì) 的不同需求，配制出供其 的營養(yǎng)基質(zhì),營養(yǎng)物質(zhì),生長繁殖,（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 . 半固體培養(yǎng)基。（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的

4、類型,固體培養(yǎng)基：菌落,用途：純化（分離），鑒定、活菌計(jì)數(shù)、保藏菌種,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,用途：增菌、工業(yè)生產(chǎn),半固體培養(yǎng)基：,無動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散),,,用途：觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種等,選擇培養(yǎng)基,1.加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌2.加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌3.無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌

5、4.不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物5.加入四環(huán)素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞,2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方,細(xì)菌喜葷，霉菌喜素,1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成,問題1：培養(yǎng)基包括哪些基本成分？,問題2：從細(xì)胞的化學(xué)元素組成來看，培養(yǎng)基中為什么都含有這些營養(yǎng)成分？,水、碳源、氮源、無機(jī)鹽,C、H、O、N、P、S是構(gòu)成細(xì)胞原生質(zhì)的主要元

6、素，約占原生質(zhì)總量的97％以上。,1.基本成分：,碳源、氮源、水、無機(jī)鹽,,⑴碳源,無機(jī)碳源：,有機(jī)碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自養(yǎng)微生物,異養(yǎng)微生物,,⑵氮源,無機(jī)氮源：,有機(jī)氮源：,NH4＋、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含C、H、O、N的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源,2.特殊營養(yǎng)物質(zhì)（生長因子）：微生物生長必需，而又無法合成。,維生素、氨基酸、堿基等,3.pH、氧氣的需求：,

7、真菌偏酸，細(xì)菌偏堿,1.概念：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。 無菌操作是培養(yǎng)微生物成功的關(guān)鍵！,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,消毒是指殺滅病原微生物的方法，滅菌是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽孢、孢子）的方法,溫和,強(qiáng)烈,部分微生物,全部微生物,不能,能,①煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min②巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min③化學(xué)藥劑消毒法:用75

8、%酒精進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源④紫外線30min消毒：照射前，可噴石炭酸或煤酚皂等消毒液加強(qiáng)消毒效果,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,3.常用的消毒與滅菌的方法,(2)滅菌的方法：,①灼燒滅菌：接種環(huán)、接種針、試管口、瓶口,②干熱滅菌：玻璃器皿和金屬用具,③高壓蒸氣滅菌：培養(yǎng)基 100kPa、121 ℃下維持15-30min,a.灼燒滅菌,3.常用滅菌的方法,b.干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。c

9、.高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.,,問題1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,還能有效避免操作者自身被微生物感染。,問題2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿；（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管；（3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,1.細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽

10、、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　)A.接種環(huán)、手、培養(yǎng)基 B.高壓鍋、手、接種環(huán)C.培養(yǎng)基、手、接種環(huán) D.接種環(huán)、手、高壓鍋,【典型例題】,【方法點(diǎn)撥】滅菌是指徹底殺滅微生物使其永遠(yuǎn)喪失生長繁殖的能力，對(duì)于培養(yǎng)基、操作器皿和接種環(huán)等都需要滅菌。消毒僅指殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌而對(duì)被消毒的物體基本無害，如操作者的手和衣著需要消毒處理。,C,2.微生物培養(yǎng)過程中，要十

11、分重視無菌操作?，F(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的許多方面也要進(jìn)行無菌操作，防止雜菌污染。請(qǐng)分析下列操作中錯(cuò)誤的是(　　)①煮沸消毒可以殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢②接種操作要在酒精燈火焰附近進(jìn)行③無菌繁殖脫毒苗時(shí)，植物的外植體要進(jìn)行消毒④家庭制作葡萄酒時(shí)要將容器和葡萄進(jìn)行滅菌⑤培養(yǎng)基要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌⑥加入培養(yǎng)基中的指示劑和染料不需要滅菌A.①③ B.②④ C.③⑤ D.④⑥,D,微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌

12、2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存,取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。,LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌的劃線分離,二.實(shí)驗(yàn)操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例),㈠.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,1.計(jì)算 2.稱量 3.溶化：可調(diào)節(jié)PH4.

13、滅菌: 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶，再放入高壓蒸汽滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。 培養(yǎng)皿：5—8套培養(yǎng)皿為一包，包好后放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160—170℃滅菌2h5.倒平板 待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種。,【方法點(diǎn)撥】倒平板的方法及注意事項(xiàng),①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；,②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火

14、焰；,③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。,④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,答：平板冷凝

15、后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,（二）純化大腸桿菌,最常用的接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法。,1.平板劃線法:通過接種

16、環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落。,1.平板劃線的操作方法,平板劃線的操作,,,,一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)則的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。,,,【注意事項(xiàng)】,1.接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。,2.

17、劃線首尾不能相接。,3.劃線后，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h。,從上次的末端開始，交叉2~3條,,最后的劃線不能與第一區(qū)相連。,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：第一步：滅菌； 每次劃線前：為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以

18、便得到菌落。劃線結(jié)束：后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。,2.稀釋涂布平板

19、法,（1）系列稀釋操作,將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠高時(shí)，即可獲得單個(gè)細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。,2.稀釋涂布平板的操作方法,注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時(shí)，試管口和移液管離火焰1~2cm處.,（2）涂布平板操作,將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中,取少量稀釋液滴加到培養(yǎng)基表面,待酒精燃盡后冷卻8～10s,用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻,涂布平

20、板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,答：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等。,培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)目過多或連成一片的原因可能是什么？,答：（1）菌液濃度過高 （2）培養(yǎng)過程中被雜菌污染 （3）利用接種環(huán)劃線時(shí)，每次劃線前 未

21、灼燒滅菌,下列關(guān)于微生物接種的描述，正確的是(　　)A.平板劃線法只用于固體培養(yǎng)基的接種，而稀釋涂布平板法只用于液體培養(yǎng)基的接種B.平板劃線法不能用于微生物的計(jì)數(shù)，而稀釋涂布平板法可用于微生物的計(jì)數(shù)C.利用平板劃線法不能得到單菌落，而利用稀釋涂布平板法能得到單菌落D.平板劃線法所用的接種工具不需要滅菌，而稀釋涂布平板法所用的接種工具需要滅菌,【方法點(diǎn)撥】這兩種接種方法都可用于固體培養(yǎng)基的接種，都能用于形成單菌落，接種器具都要進(jìn)行

22、嚴(yán)格滅菌處理。,B,1.臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2.長期保存：甘油冷凍管藏法,1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是（ ）A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽 D.無機(jī)氮源也能提供能量,D,解析：A、B選項(xiàng)的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源；有的碳源可同時(shí)是氮源；有的碳源同時(shí)是能源；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源。對(duì)于C選項(xiàng)，

23、除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。對(duì)于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是（ ）A.防止雜菌污染 B.接種前菌種要進(jìn)行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,B,退出,解析：發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），A正確；B錯(cuò)誤，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但