微生物的實驗室培養(yǎng)課件-1

1、課題1 微生物的實驗室培養(yǎng),專題2 :微生物的培養(yǎng)與應用,,微生物包括哪五類：,病毒細菌放線菌真菌原生動物,特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).,,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,,,微生物基礎知識,了解有關培養(yǎng)基的基礎知識，進行無菌技術(shù)的操作，進行微生物的培養(yǎng)。,一、課題目標：,掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無

2、菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。,無菌技術(shù)的操作。,二、課題重點和難點：,三、技能目標：,一、基礎知識：,（一）培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。,（1）按物理性質(zhì)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定等。（2）按用途功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按化學成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的類型和用途,培養(yǎng)基

3、的種類,常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種,用于微生物的分離、計數(shù),常用于工業(yè)生產(chǎn),常用于分類、鑒定,在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。,根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不

4、同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。,固體培養(yǎng)基：菌落,液體培養(yǎng)基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,半固體培養(yǎng)基：,無動力 有動力(彌散),,,(是否運動),4、微生物的五種營養(yǎng)要素,碳源 （carbon source）,氮源（nitrogen source）,生長因子（grow

5、th factor）,無機鹽（mineral salts）,水（wahtor）,凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源 。,碳源,C素構(gòu)成細胞及代謝產(chǎn)物的骨架 C素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源 自養(yǎng)微生物以二氧化碳或碳酸鹽為惟一碳源進行代謝生長；異養(yǎng)微生物必須以有機物作為碳源進行代謝生長。碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)。,碳源功能,無機C源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用有機C源：各種糖類，其次是有

6、機酸、醇類、 脂類和烴類化合物,碳源種類,凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。,氮源(nitrogin source),為微生物提供合成細胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料對許多微生物來說，既可利用無機態(tài)氮，也可利用有機態(tài)氮。  固氮微生物可以利用氮氣作為氮源進行生長。 某些種類的氮源也能為微生物提供能量，如NH3既是硝化細菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白質(zhì)等也能為微生物提供能量。,氮源功能,分子態(tài)氮：固氮微生物

7、以分子氮為唯一氮源 無機態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用 有機態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物 a實驗室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等,氮源種類,構(gòu)成微生物細胞的組成成分 調(diào)解微生物細胞的滲透壓， PH值和氧化還原電 位 有些無機鹽如S、Fe還可做為自

8、養(yǎng)微生物的能源 構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑,無機鹽（mineral salts）,無機鹽功能,構(gòu)成微生物細胞以C、H、O、N、P、S六種元素為主，約占細胞干重的95％以上； Ca、K 、Mg、Fe為大量元素，以無機鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。 Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。,

9、無機鹽種類,,微生物生長不可缺少的 微量有機物質(zhì)叫生長因子。維生素 氨基酸堿 基,生長因子,有的微生物自己不能合成維生素，需要外加，主要是B族維生素、硫胺素、葉酸、泛酸、核黃素等，如生產(chǎn)味精需加生物素（是B族中的一種即VH）。,維生素,有些微生物自己不能合成某種氨基酸，必須給予補充，如賴AA發(fā)酵所用的黃色短桿菌不能合成環(huán)絲AA，為環(huán)絲AA缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中必須添加含環(huán)絲AA的氮

10、源。如豆餅水解液或毛發(fā)水解液等。,氨基酸,嘧啶和嘌呤是核酸和輔酶的重要組分，是許多微生物必須的生長因素。 有些微生物不僅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能將補充的嘧啶和嘌呤結(jié)合在核苷酸上，還必須供給核苷酸，有的菌需補充卟啉或其衍生物，還有的菌需供給（低碳）脂肪酸等。,堿基,水,是細胞中生化反應的良好介質(zhì)；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細胞）外。 水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，不致使細胞

11、的溫度驟然上升。 維持細胞的膨壓（控制細胞形態(tài)）。,碳源、氮源、生長因子的比較,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導入了目的基因的受

12、體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細胞,根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)

13、成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限;成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)基：,2、培養(yǎng)基配制原則：,（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。 （2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。 （3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。 細菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8

14、.5； 真菌pH為：5.0-6.0。,3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成,不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,（二）無菌技術(shù),1.無菌技術(shù)的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學到的倒平板、平板劃線操

15、作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。,（１）消毒定義：　　利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,（2）滅菌的定義：,是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括所有細菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌之過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術(shù)。

16、,消毒與滅菌的比較,1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒與滅菌的方法,1、灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、試管口2、干熱滅菌：160-170 ℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 ℃下維持15-30min.,(2

17、)滅菌的方法：,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防

18、止空氣中微生物的污染而設計的。,1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,旁欄思考,3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌2

19、、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存,,三、實驗操作,（ 一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）,1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：　pH7．6　4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎,操作步驟,8．滅菌: 將50ml培

20、養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170 ℃下滅菌2h。 9．倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種. 10．無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—4

21、8小時，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板技術(shù),1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？,問題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板

22、還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,（二）、純化大腸桿菌,接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法,平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的

23、表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),菌落：,單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。例如大小，形狀，邊緣，質(zhì)地，顏色，透明度等。,菌落,細菌的菌落特征因種而異,霉菌的菌落特征因種而異,菌落,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作

24、結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

25、,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,1.菌液梯度稀釋 2.涂布 3.分散成單個細胞 4.形成菌落,問題討論,涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列

26、稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？,應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),四、結(jié)果評價與分析,（一）培養(yǎng)基的制作是否合格（二）接種操作是否符合無菌要求 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄,如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的

27、制備是成功的，否則需要重新制備。,如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。,培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生的良好的科學態(tài)度與習慣。,菌種的保存,1、臨時保藏：接種到固體

28、斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法,本課題知識小結(jié):,【典例解析】,例1．關微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源

29、，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。,答案：D,例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌C.

30、培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是A正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關的所有設備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再

31、滅菌就會把所接菌種也殺死。,例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是 。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入 .,自養(yǎng)型微生物,含碳有機物,（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。（4）表中營養(yǎng)成分共有 類。（5）不