遺傳病的診斷2

1、遺傳病的診斷,重 點(diǎn),遺傳病特有的診斷方法？及其應(yīng)用范圍？染色體檢查適應(yīng)癥基因診斷產(chǎn)前診斷,1. 產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis),2. 癥狀前診斷(presymptomatic diagnosis)3. 現(xiàn)癥病人診斷(symptomatic diagnosis),遺傳病的診斷 （diagnosis of genetic disease）,第一節(jié) 病史、癥狀和體征,1.

2、癥狀和體征：遺傳病有其它疾病相同的體征和癥狀，往往又有其本身特異性癥候群，為診斷提供初步線索。 2.病史采集：遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所 以采集病史除一般病史外，應(yīng)著重患者的家族史、婚姻史和生育史。,1. 系統(tǒng)、完整,第二節(jié) 系譜分析,2. 去偽存真,3. 新的基因突變,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算和基因定位中的連鎖分析。,第二節(jié) 系譜分析,一、孟德

3、爾式遺傳病----單基因病,1. 基因多效性(AD)2. 遺傳異質(zhì)性(AR)3. 臨床表型雜合子(XR),系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算和基因定位中的連鎖分析。,第二節(jié) 系譜分析,二、非孟德爾式遺傳病,1. 線粒體遺傳病2. 多基因病,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算和基因定位中的連鎖分

4、析。,一、孟德爾式遺傳病,第二節(jié) 系譜分析,1. 遺傳印記 2. 動(dòng)態(tài)突變 3. 單親二體 4. 性別 5.修飾基因,三、特殊遺傳方式,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算和基因定位中的連鎖分析。,二、非孟德爾式遺傳病,一、孟德爾式遺傳病,染色體檢查： 染色體檢查亦稱核型分析（karyotype analysis）是確診

5、染色體病的主要方法。 一、染色體檢查標(biāo)本的來源： 主要取自患者的外周血和身體的各種組織；胎兒的絨毛、羊水中胎兒脫落細(xì)胞和臍血、受精卵卵裂細(xì)胞、皮膚等各種組織。,第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,二、染色體檢查 的適應(yīng)癥：,1. 智能發(fā)育不全、生長(zhǎng)遲緩或伴有其它先天畸形者,2. 夫婦中有染色體異常，如平衡易位、嵌合體等3. 家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異?；蛳忍旎蝹€(gè)體4. 多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫

6、5. 原發(fā)閉經(jīng)和男女不育癥者6. 34歲以上的高齡孕婦7. 有兩性內(nèi)外生殖器畸形者,三、方法：略四、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)： 15個(gè)分裂相，其中有2個(gè)異同將增倍。不僅對(duì)染色體的情況作出正確診斷，還要了解患者異常染色體的來源，而且對(duì)生育第二胎提供咨詢。,第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,二、性染色質(zhì)檢查：優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，主要用于疑為兩性畸形或性染色體數(shù)目異常的疾病診斷或產(chǎn)前診斷，有一定價(jià)值，但確認(rèn)仍需依靠 染色體檢查。

7、,1. X 性染色質(zhì)檢查,2. Y 性染色質(zhì)檢查,一、染色體檢查 —— 核型分析,預(yù)測(cè)性別：98%。（X連鎖遺傳?。?第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,三、染色體熒光原位雜交(FISH)： 應(yīng)用標(biāo)記的特異性DNA探針與玻片上的細(xì)胞中期染色體或間期核的DNA進(jìn)行FISH檢測(cè)可完成非整倍體的檢測(cè)。,二、性染色質(zhì)檢查,一、染色體檢查 —— 核型分析,第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,第三節(jié) 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查,第四節(jié)

8、 皮膚紋理分析,一、正常皮膚紋理（一）指紋（二）掌紋（三）指摺紋和手掌摺紋（四）腳掌紋,二、染色體病患者皮膚紋理特征,基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變或缺如。因此，酶和蛋白質(zhì)的定性定量分析是診斷單基因病或分子代謝病的主要方法。,1）對(duì)酶和蛋白質(zhì)的檢查①蛋白質(zhì)的檢查：血液。異常的血紅蛋白②酶的檢查：肝、腎、皮膚、甲狀腺、腸粘膜。,A B C,,,酶,第五節(jié)

9、 生物化學(xué)檢查,苯丙酮尿癥（PKU)（AR),病因：肝中苯丙氨酸羥化酶缺乏（PAH) , PAH基因12q24 13個(gè)外顯子,苯乙酸,,苯乙酰谷氨酰氨,,,,,L-谷氨酸脫羧酶,r氨基丁酸減少,抑制,5-羥色氨脫羧酶,5-羥色氨減少,,抑制,影響大腦的發(fā)育,,,2）代謝產(chǎn)物檢查,分子代謝病可以從三個(gè)層次檢測(cè)和分析,1．酶和蛋白質(zhì)的分析：基因突變引起的單基因病主要是特定的酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)和量

10、改變的結(jié)果。 2．代謝產(chǎn)物的檢測(cè)：酶缺陷導(dǎo)致一系列生化代謝紊亂，從而使代謝中間產(chǎn)物、底物、終產(chǎn)物旁路代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。因此，檢測(cè)某些代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量的改變?？砷g接反映酶的變化而作出診斷。 3．基因分析 ：基因診斷（gene diagnosis）是利用DNA分析技術(shù)直接從基因水平（DNA或RNA）檢測(cè)遺傳的基因缺陷。,上海：1981～1987年對(duì)284,396名新生兒進(jìn)行PKU篩查，查出PKU患兒15名，高苯丙氨酸血癥4名。,

11、第五節(jié) 生物化學(xué)檢查,第六節(jié) 基因診斷,和傳統(tǒng)的診斷方法主要差異在于直接從基因型推斷表型，即可以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質(zhì)）直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)而作出診斷，這樣就改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，故基因診斷又稱為逆向診斷（reverse diagnosis）。 這一診斷方法不僅可對(duì)患者，還可以在發(fā)病前作出癥狀前基因診斷，也可對(duì)有遺傳病風(fēng)險(xiǎn)的胎兒作出生前基因診斷。此外基因診斷不受基因表達(dá)的時(shí)空限制，也不受取材的細(xì)胞類型和發(fā)病年齡的限制。

12、這一技術(shù)還可以從基因水平了解遺傳病異質(zhì)性，有效地檢出攜帶者。因此近年來這一技術(shù)日新月異地迅速發(fā)展，并已經(jīng)在遺傳病診斷中發(fā)揮了巨大作用。,第六節(jié) 基因診斷,1978年，Kan YW —— 鐮狀細(xì)胞貧血,癥狀前診斷 —— 外周靜脈血,產(chǎn) 前 診 斷 —— 孕早期的絨毛細(xì)胞,孕中期的羊水胎兒脫落細(xì)胞,母親外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞,植入前診斷 —— 受精卵卵裂細(xì)胞,定義： 應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或

13、輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷。,,思路：用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。,基因診斷的原理,核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。 基本原理是：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。 這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也

14、能在DNA和RNA之間進(jìn)行。,進(jìn)行基因檢測(cè)有兩個(gè)必要條件：一、是必需的特異的DNA探針；二、是必需的基因組DNA。 當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時(shí)，就能進(jìn)行分子雜交。,基因探針的定義：,基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列。它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。,1、來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）。2

15、、是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA 探針（cDNA probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。長(zhǎng)約20個(gè)bp左右。,探針的來源：,探針的標(biāo)記：放射性同位素標(biāo)記（32P、35S）、地辛高、辣根過氧化物酶、生物素。 方法：缺口平移、六核苷酸引物標(biāo)記法。,基因探針的標(biāo)記：,一、分子雜交

16、,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,一、分子雜交,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,2. ASO雜交,1、Southern 雜交法,細(xì)胞,Southern印跡雜交,,,,,,,,,,,,,,,一、分子雜交,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,2. ASO雜交,二、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),,聚合酶鏈反應(yīng)：（polymerase chain reaction,PCR）原理：

17、1）引物的設(shè)計(jì)：合成2個(gè)與目的DNA序列兩側(cè) 互補(bǔ)的寡核苷酸，一般長(zhǎng)約15-25bp。 2）基本條件：引物、DNA前提物質(zhì)、含有一 定離子（Mg）的反應(yīng)體系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循環(huán)：變性：93-95；復(fù)性：50-70 延伸：70-75。n個(gè)周期，2n個(gè)DNA,聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain r

18、eaction,PCR）,PCR原理,PCR原理,,,１變性,PCR原理,,,１復(fù)性,,,PCR原理,,,１延伸,,,,,PCR原理,,,２變性,,,,,PCR原理,,,２復(fù)性,,,,,,,,,PCR原理,,,２延伸,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３變性,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３復(fù)性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３延伸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,預(yù)變性

19、(93-95?C,2-5m),變性(93-95?C,30s),復(fù)性(50-70?C,30s),延伸(75?C,30-60s),總延伸(75?C,7m),,,,,,(25-35),PCR的一般過程：,經(jīng)過30次的循環(huán), 擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬(wàn)倍以上。,直接分析法,MstⅡ： CCTNAGG,鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)： 第5～7位密碼子,?A： CCTGAGGAG?S： CCTGTGGAG,,,RFLP連鎖分析,

20、,,,,,,Back,,,,,ASO斑點(diǎn)雜交,1986年，胡流清等基于點(diǎn)突變?cè)?，用寡核苷酸探針進(jìn)行基因診斷。,,Back,基因診斷的臨床檢測(cè)應(yīng)用,基因診斷在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用：在許多腫瘤中存在的：癌基因 ras、myc等的突變；抗癌基因P53、Rb等的突變、丟失的檢出。 基因診斷在個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用：親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證。,產(chǎn)前診斷（prenatal or antenatal diagnosis）又稱宮內(nèi)診斷（intrau

21、terine diagnosis）是對(duì)胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作了準(zhǔn)確的診斷。　產(chǎn)前診斷的適應(yīng)癥的選擇原則　　一、是有高風(fēng)險(xiǎn)而危害較大的遺傳病　　二、是目前已有對(duì)該病進(jìn)行產(chǎn)前診斷的手段。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,產(chǎn)前診斷的適應(yīng)癥:1、染色體?。悍驄D之一有染色體異常、生育過染色體病的 患兒夫婦之一為平衡易位攜帶者、脆性X家

22、 系的孕婦。2、單基因?。禾囟溉毕菟碌倪z傳性代謝病。3、多基因?。篘TD4、不明原因的自然流產(chǎn)史、畸胎史、死產(chǎn)、新生兒死亡、羊水過多；35歲以上孕婦、有明顯制畸史的孕婦。5、有明顯形態(tài)改變的先天畸形。,幾種主要產(chǎn)前診斷方法,1、超聲波檢查：是一項(xiàng)簡(jiǎn)便對(duì)母體無痛無損傷的產(chǎn)前診斷方法。B型超聲波應(yīng)用最廣，利用超聲波能作出的產(chǎn)前診斷或排除性診斷。此外還可直接對(duì)胎心和胎動(dòng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，并可攝象

23、記錄分析，亦可作胎盤定位，選擇羊膜穿刺部位，可引導(dǎo)胎兒鏡操作，采集絨毛和臍帶血標(biāo)本供實(shí)驗(yàn)室檢查。 范圍：多胎妊娠、羊水過多、NTD、腦積水、多囊腎、肢體短??；18周測(cè)性別：XR男性選擇性流產(chǎn)。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,2、X線檢查 ：主要用于檢查24周以后胎兒骨骼先天畸形。但因X線對(duì)胎兒有一定影響，現(xiàn)已極少使用。,3、胎兒鏡 （fetoscope） ：又稱羊膜腔鏡或?qū)m腔鏡，是一種帶有羊膜穿刺的雙套管光導(dǎo)纖維內(nèi)窺鏡。能直接觀察胎兒

24、，可于懷孕15－21周進(jìn)行操作。由于B超的應(yīng)用，此方法易引起流產(chǎn)、母體免疫反應(yīng)，已少用。 范圍： 各種類型的地中海貧血、DMD,4、羊膜穿刺 ：（amniocentesis）亦稱羊水取樣。最佳時(shí)間：是妊娠16－18周。范圍：經(jīng)體外培養(yǎng)后，可進(jìn)行染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢測(cè)、性染色質(zhì)檢查、提取DNA作基因分析，也可不經(jīng)培養(yǎng)，用微量技術(shù)作酶和蛋白質(zhì)分析或直接提取DNA作基因診斷。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,方法：B超、腰穿針穿刺、穿

25、過腹壁和子宮壁進(jìn) 入羊膜腔。 20-30ml。,應(yīng)用：1、生活的脫落細(xì)胞。-- 染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢 測(cè)、性染色質(zhì)檢查、提取DNA作基因分析 2、羊水：AFP、乙酰膽堿脂酶。,1 2 3 4

26、 CHE ACHE1、2正常3、4患者,,,,,,,5．絨毛吸?。航q毛取樣（chorionic villi aspiration sampling,cvs）方法：絨毛可經(jīng)宮頸部取樣，最好在B超監(jiān)視下進(jìn)行。絨毛枝經(jīng)處理（與蛻膜嚴(yán)格分離）或經(jīng)短期培養(yǎng)。,時(shí)間：一般于妊娠8--10周時(shí)進(jìn)

27、行。范圍：染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢測(cè)和直接抽取DNA進(jìn)行基因分析。優(yōu)點(diǎn)：時(shí)間早。 6．臍帶穿刺術(shù)（cordocentesis）： 經(jīng)母腹抽取胎兒靜脈血，可在B超引導(dǎo)下于孕中期、孕晚期（17-32周）進(jìn)行。臍血可作染色體或血液學(xué)各種檢查，亦可用于因羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗，DNA分析無法診斷而能用胎兒血漿或血細(xì)胞進(jìn)行生化檢測(cè)的疾病，或在錯(cuò)過絨毛和羊水取樣時(shí)機(jī)下進(jìn)行，在一些情況下，可代替基因分析。,胎兒的表型形態(tài)特征、分析蛋白質(zhì)和酶的