ung酶在pcr中的作用

1、UNG酶在酶在PCR中的作用中的作用UNG酶UracilNglycosylase尿嘧啶N糖基化酶(UNG)酶原理：UNG酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失鹼基的DNA鏈在鹼性介質，高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除.UNG酶的最佳活性溫度為50℃，95℃滅活。作用：為保證PCR結果的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施是使用UNG酶(UracilNGlycosylase)和

2、Taq酶熱啟動。PCR反應最常見，最重要的污染物是PCR產物，防污染熱啟動PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟，UNG酶即可將反應體系中已有的UDNA污染物中的尿嘧啶鹼基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產生的擴增，從而保證擴增結果的特異性，準確性。同時UNG酶被滅活，不會再降解新擴增的產物UDNA。高品質的UNG酶可以消除高達108的U

3、DNA產物，和熱啟動Taq酶一同用于建立含有UNGdUTP防污染體系的熱啟動PCR反應系統(tǒng)。UNG酶特征酶特征?克隆有EcoliK12UracilNGlycosylase基因的大腸桿菌經誘導表達后，再經三次過柱純化分離出來的重組蛋白。分子量25.66KDa。?反應條件：50℃，2分鐘；反應buffer:20mMTrisHCl(PH:8.0)1mMEDTA1mMDTT。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段

4、效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。1.原理：在PCR產物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。2.dUTP法

5、：用dUTP代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。3.dU引物法：合成引物時以dU代dT，這樣PCR產物中僅5ˊ端帶dU。UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（12kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物最好將dU設計在3

6、ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。4.優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。這個原因太多了假陽性就是現(xiàn)在的上海生工的產品也有時會產生這樣的情況，原因很多甚至包括反應時mg2濃

7、度，反應時間，退火溫度.....但從污染角度講主要有以下幾種可能PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱.(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.(五)設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR

8、產物達到檢測水平就適可而止.(七)選擇質量好的Eppendf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕，以防管內液體濺出.4、PCR污染解決對策（這是從另一篇文章總結而來，與前面的部分略有重復，大家隨便看看吧）PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘留污染的問題。一污染的預防進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)

9、。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行：1.標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；2.PCR擴增區(qū)，包括反應液的配制和PCR擴增；3.產物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增產物分析產物處理。切記：產物分析區(qū)

10、的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：1PCR用水應為高壓的雙蒸水；2引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區(qū)配制；3引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。(三)實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的

11、交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：1.戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；2.使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3.避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4.操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP