鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在大鼠主動(dòng)脈鈣化中的作用.pdf

1、目的：心血管系統(tǒng)鈣化常見于老年人及高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和慢性腎病患者，包括動(dòng)脈內(nèi)膜(動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)鈣化)、動(dòng)脈中層(Mo‥nckeberg's sclerosis)和心臟瓣膜鈣化，無(wú)論發(fā)生在哪個(gè)部位，都會(huì)引起血流動(dòng)力學(xué)和機(jī)械力學(xué)的改變，使動(dòng)脈管壁僵硬，收縮壓升高、舒張壓降低，脈壓差增大，冠狀動(dòng)脈灌注降低，最終將導(dǎo)致左室肥大、心肌缺血和心律失常，并增加卒中和猝死的危險(xiǎn)。近幾年冠狀動(dòng)脈鈣化對(duì)于心血管事件的預(yù)測(cè)價(jià)值備受關(guān)注，較無(wú)鈣化

2、者，任何程度的冠狀動(dòng)脈鈣化整體相對(duì)危險(xiǎn)度為4.3，3～5年冠心病事件(心肌梗死或心源性死亡)增加4倍。深入研究血管鈣化的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)血管鈣化的發(fā)生，具有重要的臨床意義。 既往認(rèn)為血管鈣化是過(guò)飽和的鈣、磷在血管壁的被動(dòng)沉積，近年證實(shí)是由細(xì)胞和分子參與的、類似于骨形成的主動(dòng)過(guò)程。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，分類上屬于PP2B家族，是唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表達(dá)

3、于細(xì)胞漿中，組織分布廣泛，通過(guò)使底物NFAT去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。研究證實(shí)CaN在心肌細(xì)胞肥大和骨代謝中具有重要作用。CaN不但參與成骨細(xì)胞分化和成骨作用，還是破骨細(xì)胞分化必需的，是否參與血管鈣化的調(diào)節(jié)過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)外尚未見有報(bào)道。 本試驗(yàn)采用華法令和維生素D3建立大鼠血管鈣化模型，測(cè)定主動(dòng)脈CaN mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性，并觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)對(duì)CaN表達(dá)及對(duì)血

4、管鈣化的影響，初步探討CaN對(duì)血管鈣化的調(diào)節(jié)作用，為血管鈣化的臨床防治提供新的思路。 方法：4w SD雄性大鼠36只，體重80～90g，隨機(jī)分為3組，每組12只。A組：對(duì)照組；B組：鈣化組；C組：環(huán)孢霉素A組；實(shí)驗(yàn)第1-8天，各組均給予維生素K115mg·kg-1·d-1，皮下注射。同時(shí)，C組另給予環(huán)孢霉素A10mg·kg-1·d-1腹腔注射；A組和B組分別給予等量生理鹽水腹腔注射。第3天開始，B、C組另給予維生素D33×105

5、U·kg-1·d-1，皮下注射，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天，及華法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持續(xù)至第8天；對(duì)照組在相同時(shí)間給予等量生理鹽水皮下注射。實(shí)驗(yàn)第9天，所有動(dòng)物麻醉后處死。開胸，暴露出心臟，分離胸主動(dòng)脈，并向下剖開腹部，分離出腹主動(dòng)脈，從主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈分叉處剪下主動(dòng)脈。取材后每組各取6只用于免疫組化測(cè)定CaNB1蛋白、原位雜交測(cè)定CaNAα mRNA和透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化，6只用于組織CaN和堿性磷酸酶

6、(ALP)活性測(cè)定。將免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果應(yīng)用Image-ProPlus圖象分析軟件，分別計(jì)算各組主動(dòng)脈組織相同面積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的累積光密度值(integrated optic density，IOD)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：(1)HE染色

7、結(jié)果示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，中層血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)排列整齊；鈣化組和環(huán)孢霉素A組大鼠主動(dòng)脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂。(2)VonKossa染色示鈣化組大鼠主動(dòng)脈中層彈性纖維間有大量黑色顆粒沉積；環(huán)孢霉素A組大鼠主動(dòng)脈中層彈性纖維間亦可見黑色顆粒沉積；對(duì)照組未見明顯黑色顆粒沉積。(3)透射電鏡下可見鈣化大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變性，線粒體水腫，嵴數(shù)量減少，排列紊亂，部分嵴和細(xì)胞膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)

8、張，有脫顆?，F(xiàn)象，部分膜融合或消失，吞飲小泡數(shù)量減少，細(xì)胞核輕度水腫，部分雙層核膜融合或消失，核輕度不整形，輕度不規(guī)則；平滑肌細(xì)胞線粒體大部分嵴和部分核膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有脫顆粒現(xiàn)象，部分核膜融合：平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)中可見鈣鹽沉積，有外膜包裹。(4)免疫組織化學(xué)結(jié)果示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見少量CaNB1蛋白表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)；鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白(8731.93±469.92)較對(duì)照組(5500.95±982.5

9、7)表達(dá)明顯增加(P＜0.01)；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白(7712.79±539.20)較對(duì)照組(5500.95±982.57)表達(dá)明顯增加(P＜0.0 1)；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白(7712.79±539.20)較鈣化組(8731.93±469.92)表達(dá)減少(P＜0.05)。(5)原位雜交結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見CaNAα mRNA表達(dá)，主要位于胞漿中；鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNAα mRNA(26420.97±

10、1697.97)較對(duì)照組(10302.17±2636.06)表達(dá)明顯增加(P＜0.01)；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNAα mRNA(16775.25±029.59)較對(duì)照組(10302.17±2636.06)表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNAa mRNA(16775.25±4029.59)與鈣化組(26420.97±1 697.97)比較表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。(6)鈣化組CaN活性(1.53±0.29μmol

11、Pi·mgprot-1·h-1)較對(duì)照組(0.90±0.39μmolPi·mgprot-1·h-1)明顯增加(P＜0.01)；CsA組CaN 活性(1.54±0.40μmolPi·mgprot-1·h-1)較對(duì)照組(0.90±0.39μmolPi·mgprot-1·h-1)明顯增加(P＜0.01)；CsA組CaN活性(1.54±0.40μmolPi·mgprot-1·h-1)與鈣化組(1.53±0.29μmolPi·mgprot-1·h

12、-1)比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。(7)鈣化組ALP活性(463.38±65.09U·gprot-1)較對(duì)照組(360.04±49.01U·gprot-1)增加(P＜0.05)；CsA組ALP活性(479.78±74.67U-1gprot)較對(duì)照組(360.04±49.01 U·gprot-1)明顯增加(P＜0.01)，與鈣化組(463.38±65.09U·gprot-1)比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1本實(shí)驗(yàn)