鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在創(chuàng)傷性軸突損傷中的作用及機(jī)理.pdf

1、彌漫性腦軸突損傷(Diffuseaxonalinjury，DAI)是創(chuàng)傷導(dǎo)致的廣泛性腦實(shí)質(zhì)軸突損傷，是非火器顱腦損傷中最嚴(yán)重的顱腦損傷之一。雖然隨著影像學(xué)的發(fā)展，DAI的臨床診斷有了一些進(jìn)步，但在治療方面尚無有效手段。 DAI的發(fā)生是由于外力直接或間接作用，神經(jīng)組織損傷后的繼發(fā)改變和損傷后修復(fù)反應(yīng)等諸多因素共同介入的結(jié)果。但究其發(fā)生的生物力學(xué)機(jī)理而言，它應(yīng)該是所有的創(chuàng)傷性顱腦損傷的共同特征，因此也被稱為創(chuàng)傷性軸突損傷(Traum

2、aticAxonalIniury，TAI)。它一般表現(xiàn)為兩種情況：當(dāng)外力引起的原發(fā)性損傷過于強(qiáng)烈時(shí)，軸突會(huì)直接離斷，即離斷型軸突損傷；同時(shí)，當(dāng)原發(fā)性損傷不足以引起軸突離斷時(shí)，即存在非離斷型軸突損傷。但是，隨著繼發(fā)性損傷的參與，部分非離斷型軸突損傷在4～24h后也會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡x斷型軸突損傷。因此，保護(hù)非離斷型軸突損傷的軸突，促進(jìn)其自我修復(fù)，促進(jìn)軸突再生無疑是治療TAI的重要策略。 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)是一種

3、活性受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中直接受Ca2+的調(diào)節(jié)，起脫磷酸化作用。它是腦內(nèi)含量最高的蛋白酶之一，主要分布在神經(jīng)元胞體和軸突、樹突中。作為一種胞內(nèi)信號(hào)蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)CaN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與了許多神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)：如免疫炎癥反應(yīng)、突觸可塑性、神經(jīng)元凋亡等。而CaN在創(chuàng)傷性軸突損傷中的作用也日益引起人們的關(guān)注。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，軸突損傷后給以CaN的抑制劑環(huán)孢霉素A(cyclosporineA，

4、CsA)或FK-506，反映前向轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的TAI指標(biāo)--APP(amyloidprecursorprotein，APP)的陽性染色軸突會(huì)減少，動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能有所改善，間接證明CaN參與了TAI的發(fā)生、發(fā)展。但目前有研究還發(fā)現(xiàn)FK-506還存在其它方式干預(yù)TAI。因此，CaN在TAI中確切的作用和機(jī)理有待于更深入的研究。 本研究于是從三個(gè)方面入手探討了CaN在TAI中的作用和機(jī)理： 1)通過比較研究不同年齡段大鼠皮層神經(jīng)元

5、CaN的活性變化，探討CaN與軸突再生能力的相關(guān)性； 2)培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元，在3、7、10d分別給予10nMCsA、10nMBDNF、10nMTTM(PP-1的抑制劑)后，檢測神經(jīng)元的神經(jīng)突起的長度、CaN的活性、βⅢ-tubulin、P-CREB、P-GAP-43蛋白表達(dá)，探討CaN在正常軸突生長中的作用及機(jī)理。 3)離體牽張損傷大腦皮層神經(jīng)元構(gòu)建軸突損傷模型，在損傷后分別給予10nMCsA、10nMTTM后，1

6、h、6h、24h、3d觀察神經(jīng)元形態(tài)改變，檢測CaN的活性、APP、βⅢ-tubulin、P-GAP-43蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討CaN在軸突牽張損傷后對軸突的作用以及機(jī)理。 本課題的主要結(jié)果和結(jié)論 1.酶底物顯色法檢測發(fā)現(xiàn)：隨著大鼠年齡的增加，其大腦皮層的CaN活性呈逐步增加的趨勢。這可能是成熟神經(jīng)元與未成熟神經(jīng)元自我修復(fù)能力差異存在的線索。 2.培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)元在加入CsA后，其CaN的活性遭到顯著抑制；

7、而BDNF刺激后，CaN活性沒有發(fā)生明顯改變。這說明CsA能夠通過抑制CaN的活性而影響其后續(xù)效應(yīng)。 3.相差顯微鏡下數(shù)碼采集細(xì)胞生長照片，SPOT軟件分析：神經(jīng)元突起的長度在3-10d隨著培養(yǎng)時(shí)間是逐漸增長，有顯著的差異。CsA、BDNF和TTM分別刺激后，神經(jīng)突起的增長更加明顯，而三種刺激的組間差別不明顯。這提示CsA與TTM可能具有BDNF那樣促進(jìn)神經(jīng)突起生長的效果。因PP-1是CaN已知的一個(gè)作用底物，所以CsA的上述作

8、用可能是通過PP-1進(jìn)行的。 4.Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)：βⅢ-tubulin、P-GAP-43、P-CREB的蛋白表達(dá)在3-10d有增加的趨勢，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異。CsA刺激后這些蛋白表達(dá)均顯著增加，但TTM的刺激卻只使βⅢ-tubulin、P-CREB的增加明顯。這提示CaN既可能直接影響GAP-43的磷酸化而影響軸突生長，還能通過PP-1、CREB發(fā)揮間接影響。 5.TAI損傷模型的建立：通過牽張損傷培養(yǎng)7

9、d的大腦皮層神經(jīng)元模擬在體損傷過程，是目前體外研究TAI較理想的模型。它具有操作簡便、損傷條件控制精確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。 6.SPOT分析、Westernblot、酶底物顯色法檢測發(fā)現(xiàn)：牽張損傷后CsA處理能顯著減少傷后3d內(nèi)APP的蛋白表達(dá)，而TTM處理，上述結(jié)果未發(fā)生顯著改變。這提示CsA對TAI具有一定治療作用。鑒于CsA還能抑制傷后CaN活性的顯著增加，說明CsA的確通過了CaN在發(fā)揮作用，而PP-1通路對軸突損傷急性期

10、的治療作用不明顯。 7.Westernblot檢測還發(fā)現(xiàn)：βⅢ-tubulin、P-GAP-43的蛋白表達(dá)在損傷后3d內(nèi)未發(fā)生明顯改變。傷后CsA的干預(yù)未能改變24h內(nèi)兩種蛋白表達(dá)的結(jié)果，但在傷后3d卻比對照明顯增加。這提示CsA能在傷后3d開始通過促進(jìn)βⅢ-tubulin、P-GAP-43的表達(dá)而影響軸突的自我修復(fù)或再生。傷后TTM的干預(yù)只在傷后3d增加了βⅢ-tubulin的蛋白表達(dá)。這提示CsA能通過了PP-1通路在傷后影