lfy類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用

1、北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2001年）LFY類基因在莖端分子組織形成及其活動(dòng)中的作用378LFYLFY類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用ExpressionPatternofLFYlikeGeneitsFunctioninShootApicalMeristemActivity98級(jí)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)系劉曼摘要LFY類基因在植物形態(tài)建成過(guò)程中具有重要作用，根據(jù)其突變體的特征，曾一度被認(rèn)

2、為是在花分生組織和花序分生組織中特異表達(dá)的“分生組織特征決定基因”，控制花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其在營(yíng)養(yǎng)分生組織甚至胚胎發(fā)生過(guò)程中都有所表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)啟動(dòng)子活動(dòng)特點(diǎn)研究、mRNA水平上原位雜交分析等各種方法，對(duì)其功能進(jìn)行深入地探討，以期全面地認(rèn)識(shí)該類基因在植物發(fā)育中的作用。AbstractAbstractLFYlikegenesplayimptantroleinplantdevelopmentwh

3、entheywerefirstisolatedfrommutantsofAntirrhinumArabidopsistheywerethoughttobe“SAMspecificdeterminatinggenes”regulatingthetransitionfrominflescencetoflowermeristem.HoweverfurtherresearchrevealedthatLFYlikegenes’activityca

4、nbefoundinembryogenesisshootapicesaxillarybudsatdifferentstagesaswellasinflowerprimdial.WeacterizedLFYpromoter’sactivityinvestigatedLFYmRNAexpressionwith北京大學(xué)政學(xué)者論文集（2001年）LFY類基因在莖端分子組織形成及其活動(dòng)中的作用380聯(lián)。但是，有研究表明，以GUS等報(bào)告基因所顯示

5、的啟動(dòng)子活動(dòng)模式可能并不一定反映該啟動(dòng)子對(duì)其原有基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)節(jié)模式。因?yàn)榛虻谋磉_(dá)不單需要啟動(dòng)子的活動(dòng)，還和一些其他因子，例如內(nèi)含子等有關(guān)。因此，要真正了解LFY基因在分生組織形成與活動(dòng)過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)，還應(yīng)有對(duì)其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA進(jìn)行原位檢測(cè)的證據(jù)。本課題即是在本實(shí)驗(yàn)室過(guò)去工作的基礎(chǔ)上，試圖從正常植株與組培過(guò)程再生植株中LFY啟動(dòng)子活動(dòng)方式的檢測(cè)和LFY基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的直接檢測(cè)兩個(gè)方面，對(duì)LFY類基因早期表達(dá)特點(diǎn)及其可能的功能等關(guān)鍵

6、問(wèn)題進(jìn)行進(jìn)一步地探討。本課題研究中主要涉及兩種基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)研究LFY啟動(dòng)子活動(dòng)方式時(shí)，我們采用報(bào)告基因的表達(dá)分析方法。報(bào)告基因通常編碼一個(gè)在離體條件下易于檢測(cè)的酶，或者編碼可以在活體條件下進(jìn)行組織化學(xué)定位的蛋白，這樣就可以提供基因表達(dá)定量的和定性的信息。gusA基因是從大腸桿菌（Escherichiacoli）中分離出來(lái)的，并且目前有一些基因盒可以允許在gusA基因的附近插入啟動(dòng)子區(qū)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄融合基因或翻譯融合基因。我們實(shí)驗(yàn)所

7、用的Plfy::GUS擬南芥和Plfy::GUS煙草、Pnfl::GUS煙草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的啟動(dòng)子（Plfy或Pnfl），當(dāng)Plfy或Pnfl活動(dòng)時(shí)，帶動(dòng)gusA表達(dá)，利用一個(gè)簡(jiǎn)單的組織化學(xué)檢測(cè)就可以精確地分析gusA融合基因的時(shí)空表達(dá)模式。用5溴4氯3吲哚葡糖苷酸（Xgluc）作為底物可以精確地進(jìn)行GUS活性的定位，這一反應(yīng)分兩步進(jìn)行：首先是切割葡糖醛酸部分，產(chǎn)生無(wú)色的吲哚氧基中間產(chǎn)物，隨后吲哚氧基中間產(chǎn)物

8、氧化成為不溶的藍(lán)色沉淀。用GUS進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）在大多數(shù)植物組織中GUS活性的本底低；（2）反應(yīng)產(chǎn)物不擴(kuò)散，在表達(dá)基因的植物細(xì)胞內(nèi)積累；（3）通過(guò)簡(jiǎn)單的擴(kuò)散或真空滲入，底物易被植物細(xì)胞吸收。當(dāng)然，也存在一些缺點(diǎn)：（1）組織化學(xué)染色后植物失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，這樣不能跟蹤檢測(cè)同一株植物不同時(shí)期的基因活動(dòng)情況；（2）由于酶和產(chǎn)物非常穩(wěn)定，因而不能真實(shí)的反映出GUS替代的那個(gè)蛋白在穩(wěn)定狀態(tài)下的豐度；（3）人們發(fā)現(xiàn)在GUS表達(dá)水平很

9、高的組織中會(huì)發(fā)生無(wú)色反應(yīng)中間產(chǎn)物滲漏的現(xiàn)象，但是，這可以通過(guò)在底物溶液中加入氧化劑高鐵氰化鉀或亞鐵氰化鉀或者二者都加（終濃度為5mmolL），來(lái)使這種滲漏減至最少（Stomp1990Masarenhas和Hamilton1992）；（4）同所有的組織化學(xué)方法一樣，其檢測(cè)結(jié)果不是定量的。而且，最致命的缺點(diǎn)是，啟動(dòng)子的分析不一定總能反映基因的真實(shí)活動(dòng)情況（如前文所述），這是在運(yùn)用報(bào)告基因方法進(jìn)行基因表達(dá)特征分析時(shí)必須注意的一個(gè)問(wèn)題。當(dāng)檢測(cè)L

10、FY基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)，我們用到了原位雜交（insituHybridization簡(jiǎn)稱ISH）技術(shù)。該技術(shù)最早是由Gall和Pardue(1969)及John等(1969)獨(dú)立發(fā)明的。其基本原理是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則（ATCG）將有放射性或非放射性標(biāo)記的外源核酸(探針：Probe)與染色體上經(jīng)過(guò)變性后的單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合成專一的核酸雜交分子再經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在染色體上的位置顯示出來(lái)。我們采用的mRNA水平的原位雜交