各類層析色譜分析技術(shù)完全講解

1、層析技術(shù),第一節(jié) 層析概述,,層析法也稱色譜法(chromatography)，是1906年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。,一、概況,1941年，英國生物學(xué)家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 194

2、4年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。 層析技術(shù)是一種分離技術(shù)，是混合物最有效的分離、分析方法。,經(jīng)典色譜（offl

3、ine),Tswett把植物綠葉的色素混合液加在一根裝有干燥固體碳酸鈣顆粒（稱固定相）的玻璃長(zhǎng)管（稱為填充色譜柱）上端;洗脫劑（亦稱流動(dòng)相）石油醚自上而下流過；在石油醚不斷沖洗下，原來在柱子上端的色素混合液向下移動(dòng)。由于色素中各組分的性質(zhì)的差異，最后分離成不同顏色的清晰色帶；將潮濕的碳酸鈣擠出玻璃管，用刀將各色帶切下，對(duì)其中的組分用合適的分析方法分別進(jìn)行測(cè)定。,現(xiàn)代色譜（online),,當(dāng)一個(gè)二組分（A和B）的混合樣品在t1時(shí)間

4、從柱頭加入;隨著流動(dòng)相不斷加入，洗脫作用連續(xù)進(jìn)行，直至A和B組分先后流出柱子而進(jìn)入檢測(cè)器;從而使各組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)后記錄在記錄紙上，或顯示在熒光屏上，或由電腦貯存后打印出來。,層析技術(shù)的原理,層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相(不動(dòng)的一相)，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動(dòng)相(攜帶樣品流過固定相的流動(dòng)體)，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，當(dāng)待分離的混合物通過固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸

5、附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的。,,二、層析法的特點(diǎn),分離效率高：復(fù)雜混合物、有機(jī)同系物、異構(gòu)體、手性異構(gòu)體。靈敏度高：可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。分析

6、速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。應(yīng)用范圍廣不足之處：被分離組分的定性較為困難。,層析應(yīng)用范圍,凡是溶于水和有機(jī)溶劑的分子和離子，在性質(zhì)上有一定差異均可通過層析方法進(jìn)行分離。分離的范圍包括：無機(jī)化合物：無機(jī)鹽類、無機(jī)酸類、絡(luò)合物類等有機(jī)化合物：烷烴類、有機(jī)酸和有機(jī)胺類、雜環(huán)類生物大分子：核酸和核苷酸類、蛋白質(zhì)、酶及肽類、多糖及寡糖類、激素類活體生物： 病毒、細(xì)菌、細(xì)胞器等,分析的參數(shù),

7、常見的層析分離法分析技術(shù)，是以混合物中分離單一成分，制備一定量的產(chǎn)品為主，以分析鑒定化合物的性質(zhì)，獲得分析參數(shù)為輔。HPLC以分析為主。通過層析方法可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行一定程度的定量、定性和純度鑒定。,按層析原理分類（一）,,按層析原理分類（二）,離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。,吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。,凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,按層析

8、過程的機(jī)理分類,按兩相所處狀態(tài)分類,超臨界分析：利用流動(dòng)相溶劑分子的氣態(tài)和液態(tài)臨界點(diǎn)的條件下進(jìn)行分離，更具專一性。,按操作形式不同分類,層析分類法,紙上層析是用濾紙作為支持劑（載體）的一種色層分析法，這種方法的基本原理一般認(rèn)為主要是利用混和物中各組分在流動(dòng)相和固定相間的分配比的不同而使之分離。 紙上層析可用于化學(xué)性質(zhì)相近的混和物的分離，特別適宜于微量物質(zhì)的分離和鑒別。而且使用的儀器簡(jiǎn)單，操作比較容易，重現(xiàn)性好。,三、層析前蛋白質(zhì)處

9、理,主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。,1、鹽析法,鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)域相互結(jié)合，形成沉淀。,2、等電點(diǎn)沉淀,在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，容

10、易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。,3、有機(jī)溶劑沉淀,降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)不同電荷之間的靜電引力，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀； 有機(jī)溶劑與水作用使蛋白質(zhì)的表面水化層厚度壓縮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水，蛋白質(zhì)間的疏水作用增強(qiáng)，從而產(chǎn)生沉淀。,四、層析基本操作過程,,上樣均一性 洗脫裝置,目的不同 檢測(cè)方法不同活性檢測(cè),基質(zhì)均勻性柱層析的L/d比值,1、柱層析的L/d比值,,2、洗脫裝置

11、,不改變?nèi)軇w系 依靠液面的水位差產(chǎn)生的靜壓力致使洗脫液不斷流經(jīng)層析柱缺點(diǎn)：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。改善：蠕動(dòng)泵或恒流泵,維持流速恒定的簡(jiǎn)易裝置,,改變?nèi)軇┫到y(tǒng),分級(jí)洗脫 在一個(gè)溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)和層析基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度相差并不很大，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過細(xì)過密，同一個(gè)洗脫級(jí)組分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)，達(dá)不到分離純化的目的。,,改變?nèi)軇┫到y(tǒng),梯度洗脫

12、 一種溶液以恒定的速度連續(xù)地進(jìn)入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經(jīng)混合后的液體以同速度沉入層析柱作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以線性梯度方式連續(xù)地發(fā)生改變。注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個(gè)峰，但有可能存在兩個(gè)性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。,線性梯度洗脫裝置,性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離： 改變緩慢的梯度洗脫→若為單峰：分級(jí)洗脫,3、結(jié)果檢測(cè),活性檢測(cè) 比活沒有提高 目的蛋白與雜蛋白并沒有分開

13、比活有所提高，但總活性回收很低 目的蛋白有損失或有失活現(xiàn)象測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可不考慮目的蛋白的生物活性,結(jié)果保存薄層層析&紙層析 照相保存or 掃描儀轉(zhuǎn)為圖形or 積分儀變成數(shù)據(jù)柱層析 檢測(cè)器、記錄儀和積分儀處理,4、層析裝置的儀器化,HPLC,與電腦、質(zhì)譜等連用,伯樂公司duoflow中高壓層析儀,安馬西亞公司akta高效快速層析儀,液相層析技術(shù),

14、概況,分離范圍：無機(jī)化合物有機(jī)化合物生物大分子活體生物應(yīng)用范圍：大規(guī)模生產(chǎn)小型制備、微量分離定性定量分析,液相層析儀,伯樂公司duoflow中高壓層析儀,安馬西亞公司AKTA高效快速層析儀,組份收集器,,操作控制,,動(dòng)力系統(tǒng),,工作臺(tái),,層析柱管,填充技術(shù),介質(zhì)的預(yù)處理：溶脹、漂洗、再生、轉(zhuǎn)型、脫氣等濕法填充：攪拌懸浮，自然沉降。填充質(zhì)量,檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器折光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器,固定相,固定相是不溶

15、于溶劑和水的固定化顆粒，又稱為層析介質(zhì)、層析填料、填充劑等。包括：無機(jī)材料：硅膠，氧化鋁有機(jī)材料：聚苯乙烯等多糖類材料：葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺,層析介質(zhì)與生物大分子的關(guān)系,大孔徑的，親水性好的球形材料。多糖類凝膠層析介質(zhì)最常用SephadexSepharoseBio-Gel缺點(diǎn)：剛性差，不耐壓，分離時(shí)間長(zhǎng),層析介質(zhì)的性能,層析介質(zhì)的形狀：球形，不定形技術(shù)指標(biāo)粒度大?。毫６刃。蛛x效果好，但流速慢均勻度：均勻

16、，流速快，峰值集中機(jī)械強(qiáng)度：強(qiáng)度高，流速快，保留值小，柱效高理化性質(zhì)：穩(wěn)定，非特異性吸附少，親水性好，耐酸堿和有機(jī)溶劑吸附容量：?jiǎn)挝毁|(zhì)量或體積的層析介質(zhì)吸附流動(dòng)相中溶質(zhì)的質(zhì)量。,流動(dòng)相,流動(dòng)相緩沖溶液：根據(jù)待分離物質(zhì)的性質(zhì)（等電點(diǎn)、極性、溶解度、穩(wěn)定性等）選擇緩沖溶液及其濃度、pH值、離子強(qiáng)度、緩沖容量等。保護(hù)劑：抗氧化劑、穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑等有機(jī)溶劑：根據(jù)待檢測(cè)物質(zhì)的極性及溶解度來選擇不同極性的溶劑。,第一節(jié) 吸附層析

17、,吸附層析,定義：利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中的各組分分離的方法。原理：層析介質(zhì)表面的吸附基團(tuán)對(duì)溶質(zhì)發(fā)生吸附作用，該基團(tuán)對(duì)不同溶質(zhì)的吸附能力的強(qiáng)弱有較大的差異，可根據(jù)這種差異性，將不同溶質(zhì)進(jìn)行分離。,原理,根據(jù)物料中各組分對(duì)固定相(吸附劑) 的吸附程度不同，以及其在相應(yīng)的流動(dòng)相(溶劑)中溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)反復(fù)的吸附—解吸—再吸附—再解吸的過程，達(dá)到分離目的。無化學(xué)鍵引入，只存在相對(duì)較弱的氫鍵力、范德華力和偶極力

18、相互作用。吸附力的產(chǎn)生,吸 附,吸附：任何兩相都可以形成界面，其中一相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在另一相表面上發(fā)生密集行為。吸附現(xiàn)象：溶質(zhì)從溶液中到停留在固體表面上的現(xiàn)象，固-氣、固-液、氣-液。吸附介質(zhì)：凡是能夠?qū)⒅車渌肿泳奂侥骋晃镔|(zhì)表面上的材料。被吸附物質(zhì)：能夠聚集在吸附介質(zhì)表面的分子。,吸附種類,物理吸附：是依靠分子間相互作用的范德華力引起的吸附，非特異性吸附，吸附速度快，吸附力較強(qiáng)。化學(xué)吸附：是依靠物質(zhì)

19、中的化學(xué)鍵的作用引起吸附，是選擇性吸附，吸附速度慢，吸附力強(qiáng)，不易解吸。復(fù)合吸附：是指物理和化學(xué)吸附同時(shí)發(fā)生。飽和吸附：在單位時(shí)間內(nèi)被吸附物在吸附介質(zhì)某一表面積上的分子與同一單位時(shí)間內(nèi)的該介質(zhì)的同一表面上解吸附的分子達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，處于該環(huán)境中吸附介質(zhì)的吸附作用達(dá)到飽和。,吸附劑的選擇,性能：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉極性：羥基磷灰石，硅膠，氧化鋁，人造沸石非極性：活性炭,吸附劑,活性炭硅膠氧化鋁

20、聚酰胺羥基磷灰石,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（一）,羥基磷灰石特點(diǎn)：抗機(jī)械強(qiáng)度弱。原理：溶質(zhì)分子中的酸性基團(tuán)與洗脫液中的磷酸根離子對(duì)羥基磷灰石中的鈣離子有競(jìng)爭(zhēng)作用。應(yīng)用：分離有序和無序的生物大分子，如分離RNA和DNA等。,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（二）,硅膠：化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附量大。原理：顆粒表面存在的很多硅酰基作為活性中心與所進(jìn)行層析的化合物形成強(qiáng)的氫鍵作用。硅酰基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，并隨著吸著的水分增加而降低吸附

21、力。制備：一種多孔性物質(zhì),因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-結(jié)合而具有三維結(jié)構(gòu),表面具有硅羥基,作吸附劑的硅膠需經(jīng)加熱處理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔徑分布分為表面多孔和全多孔兩類。硅膠既是吸附色譜最常用的固定相，也是分配色譜、離子色譜等色譜固定相的常用基質(zhì)。,硅 膠,影響表面積的因素：酸化時(shí)的pH→絮凝的速度→表面積大小→硅膠吸附能力大小其吸附活性取決其含水量：〈1%時(shí)，吸附活性最高；〉20%時(shí)，吸附活性

22、最低。硅膠的分子內(nèi)部的水分子，在活化時(shí)隨著烘烤的溫度升高，其活化的程度也不斷提高，200-2500C加熱活化時(shí)，吸附力最佳。,,,活化 加熱至100～110℃，除去硅膠表面因氫鍵所吸附的水分 當(dāng)溫度升高至500-1000℃時(shí)，硅?；撍s合轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，不再有吸附劑的性質(zhì)再生: 提高其吸附能力。 一般可用乙醇或甲醇洗滌，除去溶劑，110℃烘干活化處理,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（三）,氧化鋁：多孔的A1

23、203的聚合物，吸附性能也可通過改變其含水量加以控制。性質(zhì)：屬于疏水性吸附介質(zhì)。分離非極性化合物。優(yōu)點(diǎn)：吸附容量大，分離效果好，價(jià)格低。缺點(diǎn)：具有催化性能。堿性條件下不穩(wěn)定的化合物分離時(shí)容易發(fā)生諸如異構(gòu)化、氧化和消除等次級(jí)反應(yīng)原理：被分離的物質(zhì)與氧化鋁表面的一些羥基形成氫鍵。,,堿性氧化鋁：氫氧化鋁高溫脫水。 pH值約為9.0～10.0，分離碳?xì)浠衔锛澳承┲行曰驂A性化合物。中性氧化鋁：堿性氧化鋁經(jīng)一些

24、列處理。 pH約為7.5，分離醛、酮、醌類及核苷類化合物。酸性氧化鋁 ：氧化鋁經(jīng)一系列處理。 pH值約為4.0，分離酸性色素及醛酸類化合物。,種類及制備,,活化 200℃左右加溫4～6小時(shí)再生 棄去柱頂端的加樣部位后，依次用甲醇、稀乙酸、稀氫氧化鈉溶液和水洗滌，再經(jīng)高溫(200℃)活化,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（四）,活性炭原理：活性基團(tuán)（-OH）與被分離

25、的物質(zhì)分子中的某些基團(tuán)產(chǎn)生范德華引力形成吸附。根據(jù)材料分：動(dòng)物炭、植物炭、礦物炭根據(jù)顆粒粗細(xì)分：粉末活性炭：顆粒較細(xì)、吸附容量較大、常用于脫色顆粒活性炭：粒度大、流速快、吸附容量較小錦綸黏合活性炭：吸附能力弱應(yīng)用可分離水溶性芳香族化合物與脂肪族化合物、氨基酸與肽、單糖與多糖目前，多用于在結(jié)晶過程中進(jìn)行脫色和脫臭等操作中的簡(jiǎn)單吸附過程,活性炭,在不同的溶液或溶劑中的吸附能力是不同的在水溶液中吸附能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附

26、能力較弱；對(duì)極性化合物吸附能力較強(qiáng)，非極性的化合物吸附能力較弱；在酸性環(huán)境中吸附能力強(qiáng)；在水中對(duì)同系物的吸附量隨著同系物的分子量的增大其吸附量而增加。,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（五）,聚丙烯酰胺特點(diǎn)：化學(xué)合成的一種極性吸附介質(zhì)，適合于分離極性化合物，吸附特異性強(qiáng)，分辨率高，吸附容量大，選擇性強(qiáng)，應(yīng)用廣。原理：聚丙烯酰胺分子中的酰胺基與被分離物質(zhì)如酚類、酸類、醌類以及硝基化合物等之間的羥基和羧基形成不同強(qiáng)度的氫鍵結(jié)合而被吸附。在

27、水中形成氫鍵的能力大于在有機(jī)溶劑中對(duì)堿較穩(wěn)定，對(duì)酸尤其是無機(jī)酸穩(wěn)定性較差應(yīng)用：生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等極性與非極性化合物的分離,吸附介質(zhì)的分類及其性質(zhì)（六）,聚苯乙烯性質(zhì)：非極性吸附介質(zhì)，適于分離在分子中含有硝基、氯原子和酚羥基的化合物；吸附性強(qiáng)（具有較多的穿透孔）、剛性強(qiáng)、流速快、分辨率高。原理：被分離物質(zhì)分子中的疏水基團(tuán)與聚苯乙烯之間形成范得華力。,吸附劑的選擇,被分離物質(zhì)的特性：極性吸附介質(zhì)、非極性吸附介質(zhì)。介

28、質(zhì)的容量：選擇比表面大、吸附容量大的吸附介質(zhì)。介質(zhì)的通用性：選擇多功能的吸附介質(zhì)。介質(zhì)的穩(wěn)定性：理化性質(zhì)穩(wěn)定，不與溶劑、洗脫劑、樣品等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。介質(zhì)的剛性：選擇剛性較強(qiáng)、顆粒度均勻的吸附介質(zhì)。,上樣劑和洗脫劑的選擇,洗脫劑，上樣劑：溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。上樣劑有利于吸附介質(zhì)對(duì)溶質(zhì)的吸附洗脫劑對(duì)樣品有強(qiáng)的解吸附能力,選擇原則,純度較高；對(duì)樣品有較好的溶解度（能較完全洗脫所分離的成分）和穩(wěn)定性（不發(fā)生聚合、沉淀、

29、變性和相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)） ；粘度?。灰缀退枰某煞址珠_。對(duì)檢測(cè)器不敏感（光譜檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、pH檢測(cè)器）。,分離過程--吸附過程,吸附過程選用有利于吸附的、洗脫能力弱的溶液作為流動(dòng)相。影響因素：吸附能力的強(qiáng)弱與溶劑的性質(zhì)、極性、黏度、離子強(qiáng)度、介質(zhì)活化的程度、流速、吸附介質(zhì)的種類、樣品的性質(zhì)等因素有關(guān)。吸附量與吸附特異性的平衡協(xié)調(diào)。,分離過程—洗脫過程,柱內(nèi)的吸附介質(zhì)與吸附溶質(zhì)間不斷發(fā)生吸附—解吸附—再吸附—再解吸附的循環(huán)

30、過程。溶質(zhì)在吸附介質(zhì)上的吸附有強(qiáng)弱的差異，吸附強(qiáng)的溶質(zhì)溶解速度慢，解吸附難，保留值大。不同保留值大小的溶質(zhì)在層析柱內(nèi)的移動(dòng)過程中產(chǎn)生了差異。選擇具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相，吸附能力強(qiáng)的吸附介質(zhì)采用具有較強(qiáng)的洗脫能力的洗脫劑洗脫。溶劑的極性大，洗脫能力強(qiáng)。溶液的離子強(qiáng)度高，洗脫能力強(qiáng)。,色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語 流出曲線和色譜峰,,,在層析分離中,當(dāng)流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子流過層析柱時(shí),就會(huì)在固

31、定相和流動(dòng)相兩相之間不斷發(fā)生作用。在前進(jìn)的過程中由于被分離物質(zhì)的性質(zhì)不同導(dǎo)致其移動(dòng)速度也不同,在柱內(nèi)的滯留時(shí)間有差異。當(dāng)流動(dòng)相中的各組分在兩相中保留值不同時(shí),它們?cè)趯游鲋鶅?nèi)遷移速度就會(huì)產(chǎn)生差異。,隨著層析時(shí)間的延長(zhǎng)組分與組分之間彼此分離開.最后分別收集各組分.以組分的保留時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作圖,得到色譜峰。,基本術(shù)語,1. 基線 柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。,,,,h,

32、,,,Wb,,,,,,,Wb,,,,Wb,,,,,Wb,,,h,,,Wb,,,,h,,,Wb,,,,,h,,,Wb,,,色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，,2. 峰高,3、區(qū)域?qū)挾?標(biāo)準(zhǔn)偏差δ 即0．607倍峰高處色譜峰寬。峰寬Wb 自色譜峰兩拐點(diǎn)處做切線與基線相交點(diǎn)，這兩點(diǎn)的直線距離。半峰寬W1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬,4. 死時(shí)間t0,不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間

33、。與固定相填料的空隙體積成正比！,,流動(dòng)相中的溶質(zhì)進(jìn)入層析柱后,不被固定相所吸附,與固定相不發(fā)生任何作用,流過層析柱所收集的體積。包括柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和．當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F（L／min）計(jì)算： V0 = t0·F,5．死體積 V0,6. 保留時(shí)間tR,試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰

34、極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間。,從進(jìn)樣開始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間tR的關(guān)系如下： VR = tR·F0,7．保留體積 VR,某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保留時(shí)間，即 tR′ = tR-t0,8．調(diào)整保留時(shí)間tR′,某組份的保留體積扣除死體積后，

35、稱該組份的調(diào)整保留體積，即 VR′ = VR- V0,9．調(diào)整保留體積VR′,,某組份B的調(diào)整保留值與組份A的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值。,必須注意，相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比 .,10．相對(duì)保留值KAB (柱選擇因子),當(dāng)出現(xiàn)2個(gè)以上的峰時(shí)，KAB就是選擇性α，最早出現(xiàn)的峰為S峰，后面出現(xiàn)的某個(gè)峰為i峰。選擇性α主要決定于固定相性質(zhì)，其次是色譜柱溫度。α值越大，表示

36、固定相對(duì)組分的選擇性越高，則兩組分分離得越開。α等于1時(shí)，兩組分重疊。,α= t’R（i） / t‘R（S）=V’R（i）/ V‘R（S）,KAB = t’RB / t‘RA=V’RB/ V‘RA,分配系數(shù):在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的 濃度之比值 。分配系數(shù)大的組分在固定相上的溶解或吸附能力強(qiáng)，因此在柱內(nèi)的移動(dòng)速度慢。反之，分配系數(shù)小的組分在固定相上的溶解或吸附能力弱，在柱內(nèi)的移動(dòng)速度快。分配系數(shù)體現(xiàn)

37、了不同組分的熱力學(xué)性質(zhì)的不同,其大小反映了組分在固定相上的溶解——揮發(fā) 或 吸附——解吸 的能力。,11. 分配系數(shù)K,K=cs / cm,cs ——溶質(zhì)在固定相的濃度cm——溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度,分配系數(shù)K的物理意義,一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基

38、礎(chǔ)；某組分的K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出；分配系數(shù)K與溶質(zhì)和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，與兩相的體積、層析柱的特性無關(guān)。,分配系數(shù)K與分離性能,K決定于組分和兩相的熱力學(xué)性質(zhì)。在一定溫度下，K小的組分在流動(dòng)相中濃度大，先流出色譜柱；反之，后流出色譜柱。兩組分K值之比大，（不是指每一組分的K的絕對(duì)值越大），是獲得良好色譜分離的關(guān)鍵。分配系數(shù)與溫度成反比，增加溫度，分配系數(shù)變小。在氣相色譜分離中，柱溫是一個(gè)很重要的操作參數(shù)，溫

39、度的選擇對(duì)分離影響很大，而對(duì)液相色譜分離的影響小。,12.分配比K’ (容量因子),分配比是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的總質(zhì)量比。,1. 分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。分配比與分配系數(shù)的不同在于分配比不但與組分和兩相性質(zhì)有關(guān)，而且還與兩相體積有

40、關(guān),,,,,,,,,b,K,V,V,c,c,V,V,M,V,V,M,M,M,K’,m,S,m,s,m,m,m,S,S,S,m,S,=,×,=,=,=,K=K’β,β——相對(duì)比率,,色譜分析基本原理(1),色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以至彼此重疊，還是不能

41、分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此,要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。,,色譜分析基本原理（2）,色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題，影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散

42、）兩種色譜理論：都是以層析過程中分配系數(shù)為前提塔板理論:對(duì)層析柱的質(zhì)量的判斷和選擇有指導(dǎo)意義;速率理論:對(duì)層析分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義.,塔板理論-柱分離效能指標(biāo),塔板理論（plate theory）半經(jīng)驗(yàn)理論：將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）。該理論將一根色譜柱當(dāng)作一個(gè)精餾塔，其中的每一小段色譜柱相當(dāng)于精餾塔中的一個(gè)塔板,從而描述組分在色譜柱內(nèi)的

43、分配行為。,把色譜柱比作精餾塔，視作由許許多多小段(塔板)組成,且塔板與塔板之間不連續(xù);塔板之間無分子擴(kuò)散。組分在每塊塔板的兩相間的分配平衡瞬時(shí)達(dá)到，達(dá)到一次分配平衡所需的最小柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。一個(gè)組分在每塊塔板上的分配系數(shù)相同。流動(dòng)相以不連續(xù)的形式加入，即以一個(gè)一個(gè)的塔板體積加入，連續(xù)的色譜過程視作一個(gè)塔板中的兩相平衡過程的重復(fù)。組分進(jìn)入色譜柱后，在每塊塔板上進(jìn)行兩相間的分配。塔板數(shù)越多，組分在柱內(nèi)兩相間達(dá)到分配平衡的次

44、數(shù)也越多，柱效越高，分離就越好. 理論塔板數(shù)為:,塔板理論假定,理論塔板數(shù),,,由上式可知，組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)，峰寬度越小，則理論塔板數(shù)n越多，色譜柱效能越高。,有效塔板數(shù)和有效塔板高度,單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在t0時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：,塔板理論的不足,塔板理論是模擬在一些假設(shè)條件下而提出的，假設(shè)同實(shí)際情況有差距，所以他描述的色譜分配過程的定

45、量關(guān)系也有不準(zhǔn)確的地方。對(duì)于塔板高度H這個(gè)抽象的物理量究竟由哪些參變量決定的？H又將怎樣影響色譜峰擴(kuò)張等一些實(shí)質(zhì)性的較深入的問題，塔板理論卻不能回答。 為什么流動(dòng)相線速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有時(shí)當(dāng)U值由很小一下變得很大時(shí)，則柱效能（n）指標(biāo)并未變化許多，但峰寬各異，這些現(xiàn)象塔板理論也無能為力．塔板理論忽略了組分分子在柱中塔板間的縱向擴(kuò)散作用，特別當(dāng)傳質(zhì)速率很快時(shí)，其縱向擴(kuò)散作用為主導(dǎo)方面，這一關(guān)鍵問題并未闡述。塔板理

46、論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,速率理論,1956年van Deemter等提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。 van Deemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為,式中u為流動(dòng)相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。,A.渦流擴(kuò)散

47、(Eddy diffusion),A = 2λdp dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散。因此A＝0。,對(duì)填充柱有渦流擴(kuò)散的影響,B. 縱向擴(kuò)散（longitudinal diffusion）,B = 2rDm r ：彎曲因子，填充柱色譜，r < 1。 Dm：

48、試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（cm3·s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差; (3) 分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑;,縱向分子擴(kuò)散展寬度,r為彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況,一般小于1。Dm為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)。 Dm 隨柱溫升高而增加，與柱壓成反比;Dm 與流動(dòng)相的相對(duì)分子質(zhì)量M的關(guān)系為Dm?M-1

49、/2，故在GC中，若用氫氣作流動(dòng)相產(chǎn)生的縱向分子擴(kuò)散要比用氮?dú)鈺r(shí)嚴(yán)重。組分在液體中的擴(kuò)散系數(shù)約為氣體中的1/105,所以在液相色譜中,縱向分子擴(kuò)散一般可忽略。U為流動(dòng)相線速度。,如何減小縱向分子擴(kuò)散?,流動(dòng)相線速度越高，柱越短，組分在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越短，縱向分子擴(kuò)散程度就越小。欲使縱向分子擴(kuò)散減少，應(yīng)選擇球狀顆粒和相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)作流動(dòng)相。柱溫低,縱向分子擴(kuò)散程度就小。,C. 傳質(zhì)阻力,試樣組分的分子在兩相中進(jìn)行溶解、擴(kuò)散、

50、分配時(shí)的質(zhì)量交換過程，稱為傳質(zhì)過程；在傳質(zhì)過程中所受到的阻力叫傳質(zhì)阻力。  C u =（Cm+C s）u如何減小流動(dòng)相傳質(zhì)阻力?采用細(xì)顆粒的固定相增大組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)適當(dāng)降低流動(dòng)相線速選用短柱,速率理論的要點(diǎn),組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載

51、氣流速可提高柱效。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。各種因素相互制約，如流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。,分離度,分離度是既能反映柱效又能反映選擇性的指標(biāo)，可作為衡量層析柱分離總效能的綜合指標(biāo)，又稱總分離效能指標(biāo)或分辨率。,塔板理論和速率理論都難以描

52、述分離物質(zhì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。 分離物質(zhì)對(duì)分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響： 保留值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素； 區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動(dòng)力學(xué)因素。分離度可判斷相鄰兩組份在層析柱內(nèi)的分離情況.,,R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。對(duì)于兩個(gè)峰高相同的對(duì)稱峰，達(dá)到基線分離時(shí)，Rs=1.5，此時(shí)，兩組分的分離程度達(dá)99.87%。故常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)

53、志。 Rs＝1時(shí)，分離程度可達(dá)97.72％(兩個(gè)峰高相同)兩峰的高度相差10倍，當(dāng)Rs=1.0時(shí)，低含量組分的分離程度只有88%。,如何判斷完全分離?,,基本色譜分離方程,,柱效的影響 柱長(zhǎng)L∝n，柱長(zhǎng)? RS?，但分析時(shí)間?，且峰寬?。因此為了增高柱效，用減小塔板高度H的辦法比增加柱長(zhǎng)要好。2. 分配比的影響 k’ ?, RS?, 但k’值越大，分析時(shí)間越長(zhǎng)，峰越展寬。通常k’值選在0-10范圍內(nèi)。改變分配比的方法有：

54、改變柱溫或改變流動(dòng)相性質(zhì)和組成，或改變固定相。3. 選擇因子 α越大，柱選擇性越好，對(duì)分離越有利?？赏ㄟ^改變固定相的性質(zhì)和組成或降低柱溫等辦法，提高α。,,,流速對(duì)板高的影響,對(duì)應(yīng)某一流速，液相層析和氣相層析都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是柱效的最高點(diǎn)。對(duì)于液相層析來說，為了得到好的柱效，就要控制流速。,分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力與板高的影響,低流速時(shí)，分子擴(kuò)散占主要因素。高流速時(shí)，傳質(zhì)阻力起主要作用。書上圖2-11H=A+

55、B/u+C*uC*u （傳質(zhì)阻力隨流速增加而增加，影響顯著）AB/u （低流速時(shí)，隨流速的升高，分子擴(kuò)散影響下降迅速）,固定相顆粒大小對(duì)板高的影響,渦旋擴(kuò)散 A=2λdp，固定相顆粒越小，dp↓，A↓，H↓，柱效n↑但顆粒小，流速↓ ，分子擴(kuò)散B/u就會(huì)↑，就得提高柱壓機(jī)械強(qiáng)度高，剛性強(qiáng)的填料（HPLC）,凝膠層析,,凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是多孔的載體對(duì)不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從

56、而對(duì)混合物進(jìn)行分離。,排阻層析(Gel Filtration, GF),定義：利用生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量差異進(jìn)行層析分離的方法。也稱凝膠層析或分子篩層析特點(diǎn)：20世紀(jì)60年代，作為電泳支持介質(zhì)分離血清中蛋白質(zhì)；（分子篩作用）球型微珠，用于液相層析分離介質(zhì)；同時(shí)，也作為合成帶有配基的層析介質(zhì)應(yīng)用最廣泛的一種載體。設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、條件溫和。,優(yōu)點(diǎn)：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣

57、，不需要有機(jī)溶劑，分離效果好缺點(diǎn)：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差,凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。,排阻層析分離原理,大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速率快，先被洗出層析柱小分子物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，最后被洗出層析柱,排阻層析分離原理,原理

58、：按生物大分子相對(duì)分子量大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，保留時(shí)間長(zhǎng)，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，保留時(shí)間最短，出峰最快。與普通的篩分原理不同：大顆粒不通過，小顆粒通過。,排阻層析介質(zhì)分離范圍,分離范圍：全排阻分子：上限分子，不能起篩分作用的大分子。部分滲透分子：也稱分離分子，是凝膠介質(zhì)有效分離的分子。全滲透分子：下限分子，不能起篩分作用的小分子。,有關(guān)參數(shù)的意義,柱床體積

59、（Vt）：層析介質(zhì)經(jīng)溶脹、裝柱、沉降、體積穩(wěn)定后，所占層析柱內(nèi)的總體積。外水體積（Vo）：柱床內(nèi)凝膠顆粒之外、顆粒之間的空隙所占有的水相體積或溶劑體積。內(nèi)水體積（Vi）：凝膠吸水溶脹后，存在于凝膠顆粒內(nèi)所占有的水相體積或溶劑體積。,有關(guān)參數(shù)的意義,凝膠體積（Vg）：凝膠顆粒自身的體積，柱床體積減去外水體積和內(nèi)水體積后所占有的體積。洗脫體積（Ve）：自加樣液時(shí)開始，到洗脫組分濃度最大時(shí)出現(xiàn)的峰為止，所收集的體積。,各參數(shù)間的關(guān)系,V

60、t=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=（Ve-Vo）/ Vi分子在柱中移動(dòng)的速度取決于該分子在固定相和流動(dòng)相間的分配系數(shù)Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內(nèi)的洗脫行為。與被分離物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小、凝膠顆?？障逗途W(wǎng)狀孔徑大小有關(guān)。與層析柱的長(zhǎng)短和粗細(xì)無關(guān)?？赏ㄟ^實(shí)驗(yàn)獲得。,,Kd的意義,Kd=0Ve=Vo, 完全不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子，洗脫體積等于外水體積。（全排阻分子，無分離意義）Kd=1Ve=Vo+V

61、i,完全可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部的小分子，其洗脫體積就等于外水體積和內(nèi)水體積之和。（全滲透分子，無分離意義）01凝膠具有一定的吸附作用。（ Ve > Vo+Vi）,Ve=Vo 該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中， 因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo 該成分不被排阻而可完成進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部, 因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介

62、于0-l之間，物質(zhì)的洗脫速度隨其Kd值的 增加而降低一般物質(zhì)的Kd值是0<Kd< l。,洗脫行為可以有三種可能的情況:,凝膠層析介質(zhì),基本性質(zhì)球形顆粒，球內(nèi)部是多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。需具有化學(xué)穩(wěn)定性凝膠介質(zhì)合成后所保留的化學(xué)基團(tuán)必須具有良好的惰性，不與待分離的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響被分離的物質(zhì)原有的性質(zhì)（如生物學(xué)活性、構(gòu)象），在比較苛刻的環(huán)境中保持相對(duì)的穩(wěn)定性。無特異性吸附凝膠顆粒上

63、不存在或存在極少的離子基團(tuán)，不與溶液中的離子化合物發(fā)生離子交換、吸附或親和反應(yīng)，在低離子強(qiáng)度下，洗脫峰不出現(xiàn)脫尾，被分離的物質(zhì)有較高的回收率。,凝膠層析介質(zhì),具有較好的耐受性對(duì)有機(jī)溶劑和溫度具有較好的耐受性，在高溫下不發(fā)生熔融，在有機(jī)溶劑中不發(fā)生收縮變形。具有較好的剛性好具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，在操作壓力范圍內(nèi)，柱床體積不發(fā)變化，在層析過程中，流速不發(fā)生改變。,凝膠層析介質(zhì)分類,葡聚糖凝膠層析介質(zhì)： Sephadex由多聚葡聚糖通過

64、與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而合成的，具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠顆粒。特性：交聯(lián)度與凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑大小有關(guān)，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越小，分離的分子量就越小。不溶于水和有機(jī)溶劑，但具有很強(qiáng)的親水性（羥基）。在酸性條件下糖苷鍵容易被水解，在堿性環(huán)境中較穩(wěn)定。,凝膠層析介質(zhì)分類,葡聚糖凝膠層析介質(zhì)在高鹽條件下，體積易收縮，凝膠剛性較差。在氧化劑的作用下，羥基易于被氧化，增加了帶電荷特性，使其非特異性增強(qiáng)。對(duì)溫度具有較好的耐受性。（溶脹

65、 1100C、干膠 1200C）SephadexG系列產(chǎn)品：G后面的數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分離相對(duì)分子質(zhì)量范圍越大，凝膠溶脹體積大。（P107表2-5）,,,凝膠層析介質(zhì)分類,瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)：瓊脂糖基本結(jié)構(gòu)由?-D-吡喃半乳糖和3，6-脫水-L吡喃半乳糖相結(jié)合而成的鏈狀多糖。特性：一種大孔徑凝膠，具有良好的親水性（羥基）。交聯(lián)度隨著瓊脂的濃度增加而增大。網(wǎng)狀孔徑的大小可通過改變凝膠的交聯(lián)度來控制。,凝膠層析介

66、質(zhì)分類,瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)瓊脂糖分子中不帶電荷，非特異性吸附較少，回收率較高。經(jīng)過處理的瓊脂糖凝膠，可耐受較高的溫度，機(jī)械強(qiáng)度也較高。SepharoseB產(chǎn)品：B前面的數(shù)字表示瓊脂糖的百分濃度，瓊脂糖的濃度越高表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍越小。（P108表2-6）耐受一定的高溫、酸堿度、及變性劑（6M尿素）。,瓊脂糖系列,較常用的是Pharmacia和BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為Sepharose

67、，后者的產(chǎn)品為BioGel A。BioGel A 系列的產(chǎn)品有不同的顆粒度，有粗、中和細(xì)三檔，它們的顆粒度分別為l50μm～300 μm，80μm～150μm和40μm～80μm 。,,,凝膠層析介質(zhì)分類,聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)：是由丙烯酰胺單體，先制成丙烯基的衍生物，在交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis)作用下聚合而成多孔性聚丙烯酰胺凝膠珠。產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。 特性：穩(wěn)定性不如交聯(lián)的葡聚糖凝膠。在酸性條件下酰

68、胺鍵容易被水解生成羧酸，有離子交換作用，使介質(zhì)的非特異性吸附增加，應(yīng)避免酸性較強(qiáng)的緩沖液。具有良好的大孔性和機(jī)械強(qiáng)度。Bio-GelP產(chǎn)品：P后面的數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。（P109表2-7）,,凝膠層析介質(zhì)分類,瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質(zhì)：由瓊脂糖-聚丙烯酰胺按不同比例制成的混合型凝膠。聚丙烯酰胺為骨架（剛性好），在其中填充瓊脂糖凝膠剛性好，孔徑大。理