核酸檢測培訓(xùn)

1、核 酸 檢 測,北京萬泰研發(fā)中心2010.04.12,主要內(nèi)容,為什么要做核酸檢測？ 核酸是什么？ 怎樣進行核酸檢測？ 市場狀況,為什么要做核酸檢測？,核酸檢測（基因檢測） 現(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實驗室所要檢測和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA ) 以及反映基因轉(zhuǎn)錄水平的mRNA , 也包括侵入人體的致病微生物等所攜

2、帶的外源性基因(DNA/RNA )。,傳統(tǒng)檢測試劑（酶免ELISA）,技術(shù)特點： 檢測目標(biāo)為蛋白, 所檢測的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身,是一種間接、滯后的檢測方式。易操作，成本低。 固有不足：不能夠消除對“窗口期”標(biāo)本(抗體陰性,核酸陽性)的漏檢難于檢測病原體的不同亞型及突變型不典型血清陽轉(zhuǎn)對免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢,核酸檢測,顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮

3、 短89%，HBV縮短50%。提 高 靈 敏 度:理論上擴增體系中單拷貝的模板 也能被檢測出。特 異 性 好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測， 幾乎沒有方法學(xué)的假陽性。直接揭示病原體的存在 對操作者及檢測環(huán)境的要求較高檢測成本相對較高,輸血中可傳染病原體的“窗口期”,窗口期檢測率,核酸檢測在臨床診斷中的應(yīng)用,定性診斷 血液篩查

4、 病原體篩查診斷 SNP和耐藥突變診斷 基因型分型 遺傳病診斷 個體用藥診斷 基因鑒定和配型 ……………,定量檢測 病情的評估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察 新藥驗證 癌基因表達差異 ……………,核 酸 是 什 么？,核酸（Nucleic Acid）是一種主要位于細胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物內(nèi)。

5、 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對機體的作用等都與核酸有關(guān)。,核酸分類：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、 dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；3’?5’磷酸鍵,DNA結(jié)構(gòu),單鏈DNA形成雙鏈的原則— 堿基互補配對： G-C T-A,外部為磷酸和戊糖形成的骨架內(nèi)部

6、為堿基互補形成的共價結(jié)合區(qū)域螺旋結(jié)構(gòu),核酸在體內(nèi)的復(fù)制,DNA的熱變性,DNA受熱，會解開雙鏈互補狀態(tài)，形成單鏈；降溫會恢復(fù)雙鏈狀態(tài),怎樣進行核酸檢測？,核酸檢測的一般流程,核酸樣品的制備： 從血液、體液、組織中提取或PCR擴增樣品的檢測： 核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA等 結(jié)果判讀： 電泳、膜、熒光定量PCR儀等,核 酸 雜 交,核酸雜交是從核酸分子混

7、合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。,核酸提取,,PCR擴增,,探針點膜,,交聯(lián),,雜交,,

8、顯色,,結(jié)果判讀,,,,,,PCR,聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA的復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此

9、，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。,PCR的產(chǎn)生,實時熒光PCR,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行分析的方法,可以進行定量和定性檢測。,,,熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)

10、的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。,,熒光定量PCR標(biāo)記方法,內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen),探針特點,SYBR Green 融解曲線分析,,SYBR Green法優(yōu)缺點,優(yōu)點:對DNA模板沒

11、有選擇性適用于任何DNA􀂉使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針􀂉非常靈敏􀂉便宜,TaqMan探針法,TaqMan法優(yōu)缺點,市 場 狀 況,凱普、港龍以HPV檢測為主。浩源血篩試劑已進入審批階段。羅氏、生物梅里埃公司有HIV檢測試劑盒，均以各自公司的專利技術(shù)為主研發(fā)。,現(xiàn)狀和趨勢,1、現(xiàn)狀：公司多、競爭激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；缺乏規(guī)范；核心技術(shù)少；2、趨勢：管理部門逐漸加

12、強管理，相關(guān)標(biāo)準制訂中；進口試劑以全自動診斷平臺為主在國內(nèi)推廣，國內(nèi)廠家漸進推出自動化核酸提取儀器進入市場；,實時熒光PCR檢測的難點,1、大規(guī)模適合自動化核酸提取的樣品制備技術(shù)2、適合篩查應(yīng)用的多重PCR技術(shù)3、高通量全自動的核酸提取設(shè)備和耗材4、高通量檢測設(shè)備和配套耗材的成本控制5、質(zhì)量控制和質(zhì)量管理方法6、核心原料的成本控制,試劑質(zhì)量控制方法,1、實驗室分類和功能化2、人員培訓(xùn)和自我約束3、建立切實可行的質(zhì)量控制方法