實驗1特殊顯微鏡結(jié)構(gòu)及操作技術

1、實驗1 特殊顯微鏡結(jié)構(gòu)及操作技術,【目的】 了解TE2000-U型倒置顯微鏡的基本組件、原理，掌握其基本操作?！静牧稀?1．高等動、植物各類組織永久制片； 2．培養(yǎng)皿（瓶）中的活細胞或微生物； 3．口腔上皮細胞的臨時裝片。,【實驗用品】,1．試劑：10μg/mL羅丹明123的磷酸緩沖液（PBS）熒光染料。2．器材：倒置顯微鏡，相差顯微鏡附件（相差物鏡、轉(zhuǎn)盤聚光器、對中環(huán)形光闌和綠色濾色鏡等），微分干涉顯

2、微鏡附件（起偏鏡、檢偏鏡和渥拉斯頓棱鏡等），熒光顯微鏡附件（熒光發(fā)射器、激發(fā)濾片和阻斷濾片等），載玻片，蓋玻片，牙簽，濾紙條，擦鏡紙，鑷子，滴管。,【實驗原理和方法】,倒置顯微鏡是一種用于生物組織細胞離體培養(yǎng)觀察的光學顯微裝置，能直接對培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶的標本進行顯微觀察。由于它的物鏡、物體和光源位置剛好與立式顯微鏡顛倒，被稱為倒置顯微鏡。倒置顯微鏡的物鏡在下，聚光器在上，被觀察樣品置于位于上方的聚光器之下，聚光器具有遠大于物鏡的工作距離。

3、因此，適應于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中樣品的觀察。高檔倒置顯微鏡可根據(jù)不同觀察要求，增加相差、微分干涉反差物鏡或熒光發(fā)射裝置，構(gòu)建成相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡或熒光顯微鏡。,一、倒置顯微鏡的構(gòu)造與使用,（一）倒置顯微鏡的構(gòu)造倒置顯微鏡由目鏡、透射照明器、聚光器、載物臺、物鏡和顯微鏡機體等部件構(gòu)成，以TE2000-U顯微鏡為例介紹。TE2000-U 顯微鏡配有：T-DH 100W 透射照明器、LHS-H100P-1 12V100W 燈室、12V

4、100W 鹵素燈、TE2-PS100W 電源、T-SR 矩形載物臺、T-TD 雙目鏡筒D、CFI 10X 目鏡、T-N6 六孔物鏡轉(zhuǎn)換器，系統(tǒng)聚光器、物鏡、電源線等。,,1. 目鏡筒及目鏡 A:屈光度調(diào)節(jié)環(huán) B:目鏡 C:目鏡筒轉(zhuǎn)盤O:開 B:勃氏鏡(帶有聚焦螺釘) C:關(光閘) M:2.5 倍放大,2. 顯微鏡機體,3. 透射照明器: 透射照明器必須根據(jù)規(guī)定使用燈泡(12V100W 或6V30W)。T-DH 100W 透射照明

5、器需燈室。,A： 視場光闌調(diào)節(jié)桿 B： 濾色片滑片C： 聚光器再聚焦制動器 D： 聚光器調(diào)焦旋鈕E： 聚光器固定螺釘 F： 聚光器安裝定位孔G： 聚光器安裝定位槽 H： 聚光器轉(zhuǎn)動指緊螺釘I： 聚光器調(diào)中螺釘 J： 聚光器安裝(可轉(zhuǎn)動)支架K： LHS-H100P-1 12V100W 燈室 L： 燈室固定螺釘M： 燈室蓋指緊螺釘

6、 N： 聚光器支架(可移動)O： 聚光器支架指緊螺釘 P： 燈室線Q： 聚光器支架下降定位螺釘,,T-DS 30W 透射照明器 A： 防塵滑片(可移動) B： F 堵口滑片(可移動) C： 聚光器安裝支架 D： 6V30W 燈室 E： 濾色片滑片 F： 安裝附加裝置M4 螺紋孔,系統(tǒng)聚光器,T-DH 100W 透射照明器 A： 聚光器孔徑光闌B： 聚光器模塊C： 聚光器模塊固定螺釘D： 聚光鏡(有三

7、種可選：ELWD、LWD、HMC)E： 環(huán)形光闌調(diào)中螺釘(僅用于相差模塊中),T-DS 30W透射照明器(霍夫曼觀察),ELWD-S 聚光器,A：調(diào)中桿指緊螺釘B：調(diào)中桿 C：轉(zhuǎn)盤,SLWD 聚光器,T-SR矩形載物臺,A：載物環(huán)灣 B：載物臺Y 軸方向移動控制旋鈕 C：載物臺X 軸方向移動控制旋鈕,（二）由TE2000-U，100W 透射照明器，系統(tǒng)聚光器，以及T-TD 目鏡筒D 組成的顯微鏡系統(tǒng)。,明視場(BF)鏡檢

8、關鍵點： 從光路中卸下其它形式觀察需要的所有光學組件，聚光器調(diào)節(jié)好（調(diào)節(jié)聚焦和對中），轉(zhuǎn)動孔徑光闌調(diào)節(jié)好像的清晰度。,1. 復位,1） 逆時針轉(zhuǎn)動，松開透射照明器中的“聚光器再聚焦指緊螺釘”。2） 把“目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設置到＜O＞位。3） 把顯微鏡右側(cè)的“中間放大倍數(shù)刻度盤”打到＜1X＞。4） 逆時針轉(zhuǎn)動，松開顯微鏡右側(cè)粗∕微調(diào)旋鈕后面的“物鏡再聚焦定位環(huán)”,,2. 打開透射照明器,1） 把電源后部的“外部開關”打到開的位置；2）

9、把電源“電源開關”打開。(把開關撥至│)；3） 按下顯微鏡左側(cè)的“照明器開關”接通燈泡。,,3. 調(diào)節(jié)燈泡亮度保證色彩真實。,1） 把顯微鏡左側(cè)的“亮度調(diào)節(jié)盤”設置成＜12V100W＞；2） 把透射照明器中的“NCB11 濾色片”插入光路中；3） 把透射照明器中的“ND4 濾色片”插入光路中。,4. 調(diào)節(jié)光路,1） 把10X 物鏡轉(zhuǎn)到光路中。2） 把顯微鏡右側(cè)的“光路轉(zhuǎn)換盤”轉(zhuǎn)到＜1＞的位置。（100%光到觀察口）3） 向上推

10、透射照明器上的“視場光闌桿”完全打開視場光闌。4） 將系統(tǒng)聚光器上的“孔徑光闌桿”轉(zhuǎn)至右側(cè)極限處把“孔徑光闌”完全打開。5） 轉(zhuǎn)動聚光器調(diào)焦旋鈕把聚光器調(diào)至最低位置。,,5. 明視場觀察時對顯微鏡的調(diào)整,把“聚光器轉(zhuǎn)盤”轉(zhuǎn)到＜A＞位置。,6．調(diào)節(jié)視度及瞳距,1）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉(zhuǎn)盤”逆時針旋轉(zhuǎn)，使攝影取景框進入光路。2）用左眼對著左側(cè)目鏡，轉(zhuǎn)動目鏡 “屈光度調(diào)節(jié)環(huán)”，使取景框中的雙十字線清晰成像。3）用右眼對著右側(cè)目鏡

11、，轉(zhuǎn)動目鏡 “屈光度調(diào)節(jié)環(huán)”，使取景框中的雙十字線清晰成像。4）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉(zhuǎn)盤”順時針旋轉(zhuǎn)，使其退出光路。5）調(diào)節(jié)目鏡瞳距，將兩目鏡視場所見的影像重合在一起。,,7. 調(diào)焦,1）將樣品放置載物臺中。2）轉(zhuǎn)動同軸粗微調(diào)旋鈕，將標本對好焦。,8. 聚光器中心調(diào)節(jié),1）確信10X 物鏡在光路中。2）將“視場光闌調(diào)節(jié)桿”降低直到能從目鏡看到視場光闌像。3）轉(zhuǎn)動“聚光器調(diào)焦鈕”升降聚光器，使視場光闌像清晰地成象在標本面上

12、。4）轉(zhuǎn)動兩個“聚光器中心調(diào)節(jié)螺釘”，使視場光闌像在視場中心。5）更換40X 物鏡。6）調(diào)節(jié)“視場光闌調(diào)節(jié)桿”，使視場光闌的象與視場大致相同。7）轉(zhuǎn)動兩個“聚光器中心調(diào)節(jié)螺釘”，使視場光闌像在視場正中。,,9. 進行觀察,1）選擇要使用的物鏡2）移動系統(tǒng)聚光器上的“孔徑光闌調(diào)節(jié)桿”，使孔徑為物鏡數(shù)值孔徑的70－80%。（“把目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設到＜B＞位置，轉(zhuǎn)動勃氏鏡調(diào)焦螺釘使其聚焦，當觀察到物鏡的出瞳和孔徑光欄的象時，調(diào)節(jié)其大小。

13、）3）調(diào)節(jié)“視場光闌調(diào)節(jié)桿”使視場光闌像與視場相大致相同。4）把透射照明器里的“ND 減光片”進入或退出光路以調(diào)節(jié)視場亮度。,,10. 更換樣品,利用顯微鏡主體上的“物鏡再聚焦定位環(huán)”，照明器上的“傾斜裝置”，“聚光器再聚焦指緊螺釘，可容易更換樣品。,11. 顯微鏡操作結(jié)束后,1) 關閉電源開關(開關撥至O)2) 燈室冷卻后，把顯微鏡上的聚乙烯防塵罩蓋好。,相差（PH）顯微術,觀察透明細胞或其他透明樣品，需配相襯聚光器、相襯物鏡、

14、相襯環(huán)等附件。相襯板將衍射光推遲1/4波長，振幅相減，樣品暗，背景亮，稱正反差或暗反差，分正低（DL）、正低低（DLL）和中型暗相差（DM）。折光率較強的樣品用后者。相襯板將直射光推遲1/4波長，振幅相加，樣品亮，背景暗，稱負反差或明反差，分負中（NM）和負高（NH）。折光率較小的樣品用后者。,,關鍵點：將有ph 標記的物鏡與物鏡相同ph 標記的聚光器模塊一起送入光路，在進行顯微術前，校正(對中)物鏡里的相差板及聚光器模塊里的環(huán)形光闌。

15、,1. 用明視場（BF）顯微術對樣品聚焦。2. 相差觀察時對顯微鏡的調(diào)整。,1) 將ph 物鏡轉(zhuǎn)入光路。2) 轉(zhuǎn)動“聚光器轉(zhuǎn)盤”，使其與在光路中的物鏡(步驟1中所安置的)具有相同的ph 標記。3) 向右轉(zhuǎn)動聚光器上的“孔徑光闌調(diào)節(jié)桿”，完全打開孔徑光闌。,,3. 對中環(huán)形光闌,1) 把“目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設到位置，轉(zhuǎn)動勃氏鏡聚焦螺釘，使環(huán)形光闌像清晰。2) 用六角起子轉(zhuǎn)動聚光器模塊中的兩個“環(huán)形光闌對中螺釘”，使環(huán)形光闌像與物鏡中的相

16、差板環(huán)形像同心。3) 把目鏡筒轉(zhuǎn)盤位置再轉(zhuǎn)到上。調(diào)中心手輪,,4. 進行觀察,1) 把聚光器“孔徑光闌”完全打開。2) 移動透射照明器上的“視場光闌調(diào)節(jié)桿”，使視場光闌像大小與視場大小接近。3) 把透射照明器上的“NCB11 濾色片”從光路中移開，把“GIF 濾色片”移進光路。(提高反差)4) 可通過把“ND 濾色片”移進或移出光路來調(diào)節(jié)視場亮度。,,5. 使用不同放大倍數(shù)的物鏡進行觀察,1) 把所需放大倍數(shù)的相差物鏡移入光路。

17、2) 轉(zhuǎn)動“聚光器轉(zhuǎn)盤”，使其與在光路上物鏡（步驟1中所安置的）具有相同的ph 標記。3) 調(diào)節(jié)放入光路中的環(huán)形光闌中心。(見程序3),,6. 更換樣品利用使用顯微鏡主機上的“物鏡再聚焦定位環(huán)”，透射照明器上的“傾斜”裝置及“聚光器再聚焦指緊螺釘”，可容易更換樣品。7. 顯微鏡操作結(jié)束后與明視場顯微術步驟相同。,微分干涉（DIC）顯微術,可觀察到樣品的立體感，適用于顯微操縱等，彩色圖像。因塑料培養(yǎng)皿的不均衡張力在DIC下呈現(xiàn)干涉

18、條紋、DIC不宜用于普遍使用的塑料培養(yǎng)皿。DIC的光通亮大，可用到100倍物鏡。需配DIC聚光器等附件，使用明場物鏡。1．用明場找到視野2．壓入起偏器，選擇相應模塊3．調(diào)節(jié)孔徑光柵至最佳效果。,熒光（E）顯微術,適用于本身屬于或被染色后形成熒光體的樣品。熒光體在一定波長光（紫外或可見）的激發(fā)下發(fā)光（即熒光，波長長于激發(fā)光）。需配熒光附件和濾光器等。前者主件為激發(fā)光源，一般分汞燈系統(tǒng)和鹵燈系統(tǒng)，汞燈既適用于紫外光激發(fā)也適用于可見光激