基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)

1、第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ),,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶第二節(jié) DNA、RNA連接酶第三節(jié) DNA聚合酶第四節(jié) 其它酶,第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶,返回第三章,3.1.1 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象（ 50年代初）,EPO: efficiency of plate,,限制的實質(zhì)是切割外源DNA, 修飾的實質(zhì)是通過甲基化等修飾自身DNA而不被切割起作用的是核酸內(nèi)切酶和甲基化酶,Ⅰ型內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),3H標(biāo)記未修飾的λ 噬菌體DNA + 32P標(biāo)

2、記修飾的λ 噬菌體DNA,,不同菌株細胞,溫育一定時間,蔗糖梯度離心分析DNA,,未修飾的DNA降解 修飾的DNA未降解,表明菌株細胞中存在核酸內(nèi)切酶的活性,3.1.2 限制酶的發(fā)現(xiàn),返回第三章,3.1.3 限制性內(nèi)切酶的一般特點,返回第三章,3.1.4 限制性內(nèi)切酶的命名方式,第一個字母采用含有此酶的細菌屬名的第一個字母，后兩個字母為種名的前兩個字母，小寫，株系數(shù)字通常都省略，羅馬數(shù)字用來表示從同一個細菌中分離出的

3、不同的限制性內(nèi)切酶。比如HpaI和HpaII就是從同一種細菌中分離出來的第一種和第二種類型II的限制性內(nèi)切酶。,返回第三章,被酶切開的雙鏈DNA在端口各形成4個堿基暴露在外的單鏈，即形成粘性末端， 內(nèi)切部位為磷酸二酯鍵處,返回第三章,,5’…GTTAAC …3’ 3’…CAATTG …5’,,5’…GTT AAC …3’ 3’…CAA TTG …5’,返回第三

4、章,3.1.5 同尾酶和同裂酶,AGATCT A GATCT TCTAGA TCTAG A CGATCG C GATCG GCTAGC GCTAG C,,,,,返

5、回第三章,3.1.6 Ⅱ型酶的特點和識別位點,大多數(shù)II型酶結(jié)合并且切割回文序列，又稱為識別序列或識別位點酶切后產(chǎn)生5’磷酸突出或3’羥基突出的末端，它們統(tǒng)稱為粘性末端酶有一些在切割兩條鏈時會產(chǎn)生兩端平整(平末端)的DNA分子酶的識別位點的可以是4個、5個、6個、8個甚至更多的堿基對在分子克隆實驗中使用最普遍的是識別4個或6個堿基對的酶星號活性:非最佳條件下表現(xiàn)出的活性,返回第三章,,3.1.7 類型II限制性內(nèi)切酶的主要用途

6、,1，繪制物理圖譜（酶切位點圖譜）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,返回第三章,,,,兩個不同的DNA樣品用同一種酶酶切后，能產(chǎn)生相同的粘性末端兩個平末端DNA片段也可以進行相互拼接,2，產(chǎn)生克隆位點,返回第三章,返回第三章,3.1.8 影響核醚內(nèi)切限制酶活性的因素,(1)DNA的純度,(2)DNA的甲基化程度,(3)酶切消化反應(yīng)的溫度,(4)DNA的分子結(jié)構(gòu),(5)核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液,返回第

7、三章,3.2.1 連接酶,待連接二端之一須有磷酸根,第二節(jié) DNA、RNA連接酶,返回第三章,3.2.2 常見的DNA連接酶,大腸桿菌DNA連接酶,由細菌DNA編碼，只連接 粘性末端。T4 DNA連接酶， 由T4噬菌體侵染的大腸桿菌產(chǎn)生。噬菌體DNA編碼，對平末端的連接效率比細菌DNA連接酶高的多。熱穩(wěn)定的DNA連接酶：嗜熱高溫放線菌中分離，85度有高活性，94仍有活性。,返回第三章,3.2.3 連接酶的連接作用,返回第三章,

8、返回第三章,3.2.4 DNA的連接策略,二、平末端DNA片段的連接,一、粘性末端DNA片段的連接,(1)同聚物加尾法,返回第三章,(2)銜接物連接法,雙銜接物法,返回第三章,(3)DNA接頭連接法,返回第三章,3.2.5．熱穩(wěn)定的DNA連接酶,從嗜熱高溫放線茵菌株中分離純化能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的一種核酸酶:在85℃高溫下都具有連接酶的活性，而且在重復(fù)多次升溫到940 ℃之后也仍然保持活性。使用此種DNA連接

9、酶進行體外連接，可明顯降低形成非持異性連接產(chǎn)物的機率?，F(xiàn)已經(jīng)能夠從克隆的大腸桿菌中大量制備.,返回第三章,,3.2.6 寡核苷酸連接測定,返回第三章,也叫連接擴增反應(yīng)，是應(yīng)用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴增已知序列的靶DNA,3.2.7 連接酶鏈式反應(yīng),返回第三章,(1) 裂口連接酶鏈式反應(yīng)(P151)(2)不對稱裂口連接酶鏈式反應(yīng),,返回第三章,3.2.8 連接策略,1、匹配的粘性末端：２、平末端：３、不匹配的粘性末端：

10、,返回第三章,第三節(jié) DNA聚合酶,返回第三章,DNA聚合酶：需要模板，有多種活性，催化1個個核苷酸在鏈的3’接上去Taq DNA聚合酶 ： 來自于嗜熱的古細菌逆轉(zhuǎn)錄酶：以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成一段與mRNA互補的 DNA片段末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶：需要模板,三種活性，即5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性。3’-5’的外切活性比T4或T7聚合酶的相應(yīng)活性低得多。,3.3.

11、1 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ),返回第三章,,,,√,×,,,,,,,√,,,,√,,,,,,,√,√,返回第三章,返回第三章,枯草桿菌蛋白酶水解大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ全酶所得K1enow聚合酶仍具有5’-3’的聚合酶活性、 3’-5’的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5’-3’的核酸外切酶活性。,在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有：(1)修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3’隱蔽末端(2)標(biāo)記DNA

12、片段的末端(3)cDNA克隆中的第二鏈cDNA的合成(4)DNA序列測定。,3.3.2 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ K1enow片段,返回第三章,返回第三章,從T4噬菌體感染的大腸桿菌中純化。由噬菌體基因43編碼的.具有兩種酶催活性，即5’-3’ 聚合活性、 3’-5’ 外切活性可以用來標(biāo)記DNA平末端或隱蔽的3’ 末端。在沒有核苷三磷酸存在的條件下， 只具有3’-5’ 外切活性.,3.3.3 T4DNA聚合酶和取代合成法標(biāo)記

13、DNA,返回第三章,3.3.4 反轉(zhuǎn)錄酶,最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒(AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶，由兩條多肽鏈組成.其中一條肽鏈具有反轉(zhuǎn)錄酶活性和RNaseH活性。RNaseH活性是一種核酸外切酶，它以5’-3’ 或 3’-5’的方向特異地降解RNA—DNA雜交分子中的RNA鏈。另一條肽鏈則具有以RNA—DNA雜交分子為底物的5’一3’脫氧核酸外切酶活性,返回第三章,返回第三章,3.3.5 Taq DNA聚合酶,是從一種水生

14、棲熱菌分離提取的。嗜熱真菌能在70～75℃生長。該菌是1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉 中分離。,返回第三章,(一)酶活性與熱穩(wěn)定性,每個酶分子每秒鐘可延伸約150bp，70℃ 60bp/秒，55℃ 24bp/秒。 過高(90℃以上) 或過低(22℃)都可影響酶的活性。 在90℃以上幾乎無DNA合成， 但有良好的熱穩(wěn)定性。在92.5℃、95℃ 、97.5℃時，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min，40

15、min和5～6min后，仍可保持50%的活性。 Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄活性。,返回第三章,(二)離子依賴性,Mg2+依賴性酶，非常敏感。Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mg2+的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整。一般反應(yīng) 中Mg2+比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。適當(dāng)濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L。,返回

16、第三章,(三)忠實性,TaqDNA聚合酶具有5‘→3’聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性，而無3‘→5’外切活 性沒有校正功能。Taq DNA聚合酶的堿基錯配機率為2.1×10-4.,返回第三章,(四)抑制劑,低濃度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSD) 無影響極低濃度的離子表面活性劑如脫氧膽胺酸鈉(小于0.06%)，十二烷 基肌氨酸鈉(小于0.02%)，十二烷基硫酸鈉(SDS，小于0.01%)幾乎

17、可完全抑制該酶的 活性.非離子表面活性劑在較高濃度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如>5%時抑制酶活性.低濃度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增強酶活性.低濃度SDS對酶的抑制作用可加入一定濃度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在-20℃貯 存至少6個月。,返回第三章,３.３.６　T7 DNA聚合酶,由兩種亞基組成：一種是T7噬菌體編碼的基因5蛋白；另一種是

18、大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。基因 5蛋白是一種非加工的DNA聚合酶，具有單鏈的3’、5’核酸外切酶活性。硫氧還蛋白作為一種輔助蛋白，增加基因 5蛋白同引物模板的親合性，使DNA的加工合成達數(shù)千個核苷酸?；?蛋白質(zhì)一硫氧還蛋白復(fù)合物（T7 DNA聚合酶）是已商品化生產(chǎn)的加工的 DNA聚合酶。它一旦同多核苷酸模板鏈結(jié)合，便會不間斷地合成互補鏈。除此之外，T7 DNA聚合酶還具有很高的單鏈及雙鏈的 3’－5’核酸外切酶活性。,返回第三章

19、,T7 DNA聚合酶有如下幾個方面的用途：,①從大分子量模板（例如M13）上引物開始的DNA延伸合成，它能夠根據(jù)同樣的引物模板延伸合成數(shù)千核苷酸，中間不發(fā)生任何解離現(xiàn)象，同時基本上也不受 DNA二級結(jié)構(gòu)的影響（大腸桿菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶則不然）。②如同 T4 DNA聚合酶一樣，可以通過單純的延伸或取代合成的途徑，標(biāo)記DNA的3’一末端。③可以用來將雙鏈 DNA的末端補平。,返回第三章,修飾的 T7 DNA聚合

20、酶,應(yīng)用化學(xué)方法，對天然的T7 DNA聚合酶進行修飾，使之完全失去 3’一5’的核酸外切酶活性。聚合作用的速率增加了 3倍。,返回第三章,３.３.７　末端轉(zhuǎn)移酶,平頭末端3’加接一段多聚A或C等，成為粘性末端5’---------3’ dATP 末 5’---------AAAA3’ 3’---------5’ 端轉(zhuǎn)移酶 3’AAAA---------5’,返回第三

21、章,返回第三章,第四節(jié) 其它酶,3.4.1 核苷酸激酶,返回第三章,返回第三章,3.4.2 堿性磷酸酶,返回第三章,,3.4.3 核酸外切酶,返回第三章,返回第三章,可制備鏈特異的放射性探針（同用 T4 DNA聚合酶取代合成類似）。構(gòu)建單向缺失。因為exolll是雙鏈特異的，優(yōu)先降解具3’一隱蔽末端的雙鏈DNA分子。這種特性可用來構(gòu)建一組從克隆DNA某一特定部位開始的單向缺失。,返回第三章,3.4.4 單鏈核酸內(nèi)切酶與RNA分子定位