酶分子修飾

1、第十二章 酶分子修飾,一、酶分子修飾的原因,酶在生物技術(shù)中占有核心地位酶具有反應(yīng)專一性、催化效率高及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面得到越來越多的應(yīng)用。,大規(guī)模應(yīng)用的酶及酶工藝尚不夠多，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因是多方面的，這主要表現(xiàn)在：(1) 穩(wěn)定性酶是生物活性大分子。一旦離開生物細(xì)胞，離開其本身特定的作用環(huán)境，在發(fā)酵分離提純、反應(yīng)、制劑及固定化等過程中，常常顯得不夠穩(wěn)定，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。,（2）作用的最適

2、條件（pH中性、室溫，溶液狀態(tài)） 一般酶反應(yīng)是在基本接近中性，與室溫相距不大的水溶液中進(jìn)行的。在工業(yè)應(yīng)用上，由于產(chǎn)物、底物帶來的影響，作用時的pH常常不在中性范圍內(nèi)。溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快，但酶往往不穩(wěn)定，如果降低溫度，又影響反應(yīng)速度。底物不溶于水時，酶就更難發(fā)揮作用。,（3）酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng) （Km值大，與底物的親和力小）米氏常數(shù)Km值過大，使反應(yīng)在低底物濃度下不能高速進(jìn)行，由于體內(nèi)各種代謝物質(zhì)的濃度

3、較低，對Km較大的酶用于臨床檢測或治療時，影響就更大。,（4）臨床應(yīng)用的特殊要求絕大多數(shù)酶來自動、植物及微生物，對人體來說這些酶都是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，都有可能引起人體的過敏反應(yīng)。酶進(jìn)入人體后也常會由于一些蛋白酶、抑制劑或抗體的作用而失去其活力，特別是當(dāng)酶進(jìn)入體內(nèi)以后不能迅速到達(dá)或集中于病灶時，這種情況尤為明顯。,（一） 如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性?（二）如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑?（三）如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性

4、與抗蛋白水解酶?（四）如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境?,總結(jié): 解決的問題 ？,二、酶的分子工程,（一）基本內(nèi)容 1、酶分子改造： 對酶蛋白的主鏈“切割”，即根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究，通過一種相應(yīng)的方法，去掉酶分子那些與活性無關(guān)而有礙應(yīng)用的部分，提高其活性，增加穩(wěn)定性。 2、酶分子模擬： 根據(jù)酶作用原理的研究，模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)合成的方法制備高效、專一、分子較簡單、較穩(wěn)定的新型催化

5、劑。（模擬酶）,3、酶的化學(xué)修飾： 即在體外將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價連接，從而改變酶的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。,（二）酶的分子工程分類 1、分子生物學(xué)水平利用工程方法對DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶蛋白。,2、蛋白質(zhì)水平 通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的結(jié)構(gòu)。人們用化學(xué)法或酶法對酶的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。包括酶的一級結(jié)構(gòu)

6、中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定。另一方面是對酶分子中氨基酸殘基的修飾，即酶的化學(xué)修飾。,5.1 什么是酶分子修飾？,通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。,酶分子修飾的意義,提高酶的催化效率增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 stability降低或消除酶的抗原性 immunological property研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和

7、各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structure,5.2 酶分子修飾的基本要求和條件,對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。,5.3 酶分子的修飾方法,金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾核

8、苷酸鏈剪切修飾氨基酸置換修飾核苷酸置換修飾酶分子的物理修飾,,第一節(jié) 金屬離子置換修飾 一、 概念 通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。,二、作用范圍含有金屬離子的酶 金屬酶特點：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。（ 1 ）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（ 2 ）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)

9、不同特性。,超氧化物歧化酶（SOD）分子中的Cu2+、Zn2+,,金屬離子置換修飾的過程,a. 酶的分離純化： b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。 c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子

10、，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。,作用：,1、闡明金屬離子對酶作用的影響2、提高酶活力 如:將其它雜離子型的α-淀粉酶都換成鈣離子型,會提高酶活力與穩(wěn)定性;結(jié)晶鈣型α-淀粉酶活力比一般結(jié)晶雜離子型α-淀粉酶活力提高3倍以上，穩(wěn)定性也大增。 蛋白酶(鋅型，Zn2+): 用Ca2+置換Zn2+成鈣型蛋白

11、酶，鈣型蛋白酶活性提高20~30%。 3、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 如: Fe-SOD→Mn-SOD,對H2O2穩(wěn)定性增強(qiáng),對NaN3敏感性顯著降低.,4、改變酶的動力學(xué)特性包括Km與最適pH和最適溫度等,四、常用的金屬離子二價離子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。,第2節(jié) 大分子結(jié)合修飾,利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分

12、子結(jié)合修飾法，簡稱為大分子結(jié)合法。目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法。,大分子修飾的過程,1、修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。,PEG應(yīng)用最為廣泛溶解度高，既能溶解于水，也能溶解大多數(shù)有機(jī)溶劑通常沒有抗原性也沒有毒性生物相溶性好分子末端具有兩個可以被

13、活化的羥基，可以通過甲氧基化將其中一個羥基屏蔽起來，成為只有一個可被活化羥基的單甲氧基聚乙二醇（MPEG）。,常用的大分子修飾劑單甲氧基聚乙二醇（MPEG）可以采用多種不同的試劑進(jìn)行活化，制成可以在不同條件下對酶分子上不同基因進(jìn)行修飾的聚乙二醇衍生物。,2、修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。,3、修飾：將帶有活化基團(tuán)的大

14、分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。,,4）分離： 通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。,二、大分子結(jié)合修飾的作用,提高酶催化效率:每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶催化效率達(dá)到原有酶活力的5.1倍等。增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性：利用聚乙二醇修飾SOD

15、可將其相對穩(wěn)定性提高350倍。降低或消除酶蛋白的抗原:利用水溶性大分子對酶進(jìn)行修飾，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇（PEG）結(jié)合修飾后，其抗原性顯著降低；用聚乙二醇對色氨酸酶進(jìn)行修飾，可完全消除該酶的抗原性；聚乙二醇結(jié)合修飾后的L-天門冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。,采用一定的方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能，這種酶分子修飾方法稱為酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾。由于酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾

16、一般采用化學(xué)手段，故屬于化學(xué)修飾法。,第三節(jié) 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾,在酶學(xué)方面可以用于研究酶分子的結(jié)構(gòu)和功能，可以測定某一種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量。在酶工程方面可以提高酶的活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性，并且可能引起酶的催化特性和催化功能的改變，以提高酶的使用價值。還可能獲得自然界原來不存在的新酶種，如某些抗體酶和人工改造的核酸類酶等。,酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)，主要包括：,氨基羧基巰基胍基

17、酚基吲哚基咪唑基,各種小分子修飾劑雙功能團(tuán)的化合物進(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾， 如戊二醛、己二胺等各種大分子與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)形成共 價鍵而進(jìn)行大分子結(jié)合修飾,修飾方法,一、氨基的化學(xué)修飾,常用氨基修飾試劑：亞硝酸、醋酸酐、琥珀酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、２,４-二硝基氟苯（DNFB）、碘代乙酸、丹磺酰氯（DNS）、O-甲基異脲。,R-CH-COOH + HNO2 = R-CH-COOH + N2 + H2

18、O | | NH2 OH,如用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽鏈中的賴氨酸殘基上的氨基產(chǎn)生脫胺作用，變成羥基。經(jīng)過修飾后，酶的穩(wěn)定性大大提高，使其在體內(nèi)的半衰期延長2倍。,２，４-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）（又稱二甲氨基萘磺酰氯）,可以專一地與多肽鏈N端氨基酸殘基的氨基反應(yīng)。據(jù)此

19、可以進(jìn)行肽鏈的N端氨基酸的檢測。,二、羧基的化學(xué)修飾,常用羧基修飾試劑：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異唑鹽等,E-C-OH + R-N=C=N-R’ = E-C-O-C=N-R || || | O O NH-R’ 酶 碳二亞胺

20、酶碳二亞胺衍生物,碳二亞胺是酶分子羧基修飾最普遍采用的修飾劑。用此修飾法可以定量測定酶分子中羧基的數(shù)目。,三、巰基修飾,巰基的親核性很強(qiáng)，是酶分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)之一。通過巰基修飾，往往可以顯著提高酶的穩(wěn)定性。常用的巰基試劑有?；瘎?、烷基化劑、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉。,其中烷基化試劑（如碘乙酸等）是一種重要的巰基修飾劑，經(jīng)過烷基化修飾的酶分子相當(dāng)穩(wěn)定，而且通過熒光檢測技術(shù)很容易檢測其修飾結(jié)果?，F(xiàn)

21、在已經(jīng)開發(fā)出許多含有碘乙酸的熒光試劑。,E-SH+ICH2COOH = E-S-CH2COOH+HI 酶 碘乙酸 酶-乙酸衍生物,N-乙基馬來酰亞胺（NEM）是一種反應(yīng)專一性很強(qiáng)的巰基修飾劑,能與酶分子的巰基形成穩(wěn)定的衍生物,反應(yīng)產(chǎn)物在300nm處有最大光吸收。,,四、胍基修飾,精氨酸含有胍基。胍基可與二羰基化合物縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。所以二羰基化合物，如環(huán)已二酮、丙二醛、苯乙二醛等，都可以用作胍基修飾劑。經(jīng)過

22、胍基修飾后的酶蛋白，其空間構(gòu)象將有所改變。,五、酚基修飾,酚基的修飾包括酚羥基的修飾和苯環(huán)上的取代修飾。酚基修飾的方法主要有碘化法、消化法、琥珀?；ǖ取Ｆ渲兴南趸淄椋═NM）可以高度專一地對酚羥基進(jìn)行修飾。,例如，枯草桿菌蛋白酶的第104位酪氨酸殘基上的酚基經(jīng)四硝基甲烷消化修飾后，生成3-硝基酪氨酸殘基，由于負(fù)電荷的引入，使酶對帶正電荷的底物的結(jié)合力顯著增加。,六、咪唑基修飾,常用的咪唑基修飾劑有碘乙酸、焦碳酸二乙酯等。,七、吲哚

23、基修飾,色氨酸殘基由于其疏水性較強(qiáng)，通常位于酶分子的內(nèi)部。而且比較不活潑，其反應(yīng)性比較差。所以一般的試劑難于對吲哚基進(jìn)行修飾。,八、分子內(nèi)交聯(lián)修飾,通過分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定，從而提高酶分子的穩(wěn)定性。例如，采用葡聚糖二乙醛對青霉素?；高M(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使該酶在55℃條件下的半衰期延長9倍，而其最大反應(yīng)速度不改變。,采用雙功能基團(tuán)化合物與酶分子相距相近兩個側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾

24、方法,雙功能基團(tuán)化合物根據(jù)其功能基團(tuán)的特點可以分為：,同型雙功能基團(tuán)化合物的兩端具有相同的功能基團(tuán),OHC-（CH2）3-CHO,異型雙功能基團(tuán)化合物的兩端具有不相同的功能基團(tuán),值得注意的是分子內(nèi)交聯(lián)是在同一個酶分子內(nèi)進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)，如果雙功能試劑的2個功能團(tuán)分別在2個酶分子之間或在酶分子與其他分子之間進(jìn)行交聯(lián)，則可以使酶的水溶性降低，成為不 溶于水的固定化酶，謂之交聯(lián)固定化。,第三節(jié)：肽鏈有限水解修飾,酶的催化功能主要決定于酶的活性中

25、心的構(gòu)象，活性中心部位的肽段對酶的催化作用是必不可少的，而活性中心以外的肽段起到維持酶的空間構(gòu)象的作用。,酶蛋白的肽鏈被水解以后，將可能出現(xiàn)以下3種情況中的一種：若肽鏈水解后引起酶活性中心的破壞，則酶將失去其催化功能；若將肽鏈的一部分水解后，仍可維持其活性中心的完整構(gòu)象，則酶的活力仍可保持或損失不多；若肽鏈的一部分水解除去以后，有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催化部位的話，則酶可顯示出其催化功能或使酶活力提高。

26、 在后兩種情況下，利用肽鏈的有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，而改變酶的特性和功能的方法，稱為肽鏈有限水解修飾。,,N端,a、胃蛋白酶原的激活,天門冬氨酸酶通過胰蛋白酶進(jìn)行修飾，從其羧基末端水解切除10多個氨基酸殘基的肽段，可使天門冬氨酸酶的催化效率提高4—5倍以上。,若將酶分子經(jīng)肽鏈有限水解，其分子量減小，就會在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性顯著降低，甚至消失。例如：將木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解，

27、使其全部肽鏈的三分之二被水解除去，該酶的酶活力保持不變，而其抗原性大大降低。又如：酵母的烯醇化酶經(jīng)有限水解除去由150個氨基酸組成的肽段后，酶活力仍可保持，抗原性卻顯著降低。,對酶進(jìn)行肽鏈有限水解，通常使用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑。此外也可采用其他方法使肽鏈部分水解，達(dá)到修飾目的。例如，枯草桿菌中性蛋白酶，先用EDTA處理，再經(jīng)純水或稀鹽緩沖液透析，可使該酶部分水解，得到仍有蛋白酶活性的小分子肽段，用作消炎劑使用時，不產(chǎn)

28、生抗原性，表現(xiàn)出良好的治療效果。,第四節(jié)：氨基酸置換修飾,若將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，則會引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的某些特性和功能，這種修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。,一、氨基酸置換修飾的作用,◆提高酶催化效率： 酪氨酸—tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所對應(yīng)tRNA合成酪氨酰tRNA，若將該酶第51位的蘇氨酸（Thr51）由脯氨酸置換，修飾后的酶對ATP的親和性提高近100倍，催化效率提高25倍。

29、 ◆增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 T4—溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸(ILu—3）換成半胱氨酸后，該半胱氨酸(Cys—3)可與第97位的半胱氨酸(Cys—97)形成二硫鍵，氨基酸置換修飾后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。◆使酶的專一性發(fā)生改變,二、氨基酸置換修飾的方法,化學(xué)修飾法： 例如：Bender和kosland成功地利用化學(xué)方法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，經(jīng)修

30、飾后，該酶對蛋白質(zhì)和肽的水解能力消失，但卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)方法進(jìn)行氨基酸置換，難度較大，受到諸多限制，難于工業(yè)化生產(chǎn)。,定點突變技術(shù)：（site directed mutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。

31、定點突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。,,酶分子的定點突變,1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計進(jìn)行基因定點突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析,第五節(jié)：酶分子的物理修飾,通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為物理修飾。,◇可以了解在不同的物理條件下，特別是在極端條件下，由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能

32、的變化情況?！筮€可能提高酶的催化活性，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性或者是酶的催化動力學(xué)特性發(fā)生某些改變。,例如：羧化酶經(jīng)高壓處理后，底物特異性發(fā)生改變，有利于催化肽的合成反應(yīng)，而水解反應(yīng)的能力降低；用高壓方法處理纖維素酶以后．該酶的最適溫度有所降低，在30-40℃的條件下，高壓修飾酶比天然酶的活力提高10％。,特點：不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。,第六節(jié) 核苷酸鏈剪切修飾及置

33、換修飾,在核苷酸的限定位點進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以改變酶的催化特性。這種方法稱為核苷酸鏈剪切修飾（例如四膜蟲26SRNA前體經(jīng)過經(jīng)自我剪接形成成熟的多功能核酸類酶L-19IVS。將酶分子核苷酸鏈的特定的核苷酸替換為另一個核苷酸，從而使酶的催化特性改變。這種方法稱為核苷酸鏈置換修飾.置換修飾。,核酸類酶：主要由核苷酸組成。,第七節(jié) 酶分子修飾的應(yīng)用,在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用在醫(yī)藥方面的應(yīng)用在工業(yè)方面的應(yīng)用在抗體酶研究方面

34、的應(yīng)用在核酸類酶人工改造在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,從20世紀(jì)50年代開始，酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾已經(jīng)成為生物化學(xué)和酶學(xué)研究的熱門課題。主要用于研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。對酶學(xué)的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)。,在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用,酶的活性中心研究酶的空間結(jié)構(gòu)研究酶的作用機(jī)制研究,★ 增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性 T4—溶菌酶分子中第3位的異亮氨酸(ILu—3）換成半胱氨酸后，該半胱氨酸(Cys—3)可與第97位的半胱氨酸(Cys—97)

35、形成二硫鍵，氨基酸置換修飾后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。,★ 降低或消除酶抗原性 具有抗癌作用的精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾，其抗原性被消除； 對白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾后，使抗原性顯著降低甚至消除。1994年正式作為治療急性淋巴性白血病的藥物在臨床使用。,在醫(yī)藥方面的應(yīng)用：,超氧化物歧化酶，經(jīng)過大分子結(jié)合修飾，形成聚乙二醇-超氧化物歧化酶

36、（PEG-SOD），其穩(wěn)定性顯著提高，在血漿中的半衰期可以延長350倍。采用葡聚糖二乙醛對青霉素酰化酶進(jìn)行分子內(nèi)交聯(lián)修飾，可以使該酶在55℃條件下的半衰期延長9倍，而其最大反應(yīng)速度不改變。用亞硝酸修飾L-天冬酰胺酶，使其氨基變成羥基。經(jīng)過修飾后，酶的穩(wěn)定性大大提高，在體內(nèi)的半衰期延長2倍。,■提高工業(yè)用酶的催化效率 采用大分子結(jié)合修飾，使每分子胰蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力可以達(dá)到原有酶活力的5.1倍。

37、,在工業(yè)方面的應(yīng)用：,通過金屬離子置換修飾，將雜離子型α-淀粉酶全部置換為鈣型α-淀粉酶，其催酶化效率可以提高3倍以上，而且穩(wěn)定性大大增加。故此，在α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)、保存和應(yīng)用過程中，添加一定量的鈣離子，有利于提高α-淀粉酶的活力和穩(wěn)定性。,■增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性,■改變酶的動力學(xué)特性,,經(jīng)過琥珀?；揎椇螅咸烟钱悩?gòu)酶的最適pH值下降0.5，并增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，更加有利于果葡糖漿和果糖的生產(chǎn)。,如果對酶分子進(jìn)行側(cè)鏈基團(tuán)修飾，使酶分子

38、表面的基團(tuán)增強(qiáng)疏水性，就可能使酶溶解于有機(jī)溶劑，均勻地分布于溶劑中，就有可能提高酶的催化效率和穩(wěn)定性。,例如，采用單甲氧基聚乙二醇對脂肪酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等酶分子表面上的氨基進(jìn)行共價結(jié)合修飾，得到的修飾酶能夠均一地溶解于苯和氯仿等有機(jī)溶劑中，并具有較高的催化活性和穩(wěn)定性。,在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用,在抗體酶開發(fā)中的應(yīng)用在核酸類酶改造中的應(yīng)用,作業(yè),何謂金屬離子修飾？如何進(jìn)行金屬離子修飾？何謂大分子結(jié)合修飾，如何進(jìn)行大分子