戴春華。凋亡抑制因子在肺癌放射耐受機理中的作用

1、,凋亡抑制基因在肺癌放射耐受機理中的作用及臨床應用研究 戴春華,今天著重討論下面一些問題,腫瘤治療的困惑個體化治療的要求目前熱門的研究假設與設想前期的研究與進展我們的一些研究工作研究目標和預期研究成果,,一、腫瘤治療的困惑,肺癌是全球發(fā)病率和死亡率增加最快的腫瘤，在中國肺癌發(fā)病率和病死率，居惡性腫瘤的首

2、位，并仍在快速直線攀升 。 但在肺癌發(fā)病率不斷增長的同時，由于缺乏有效的早期診斷方法和治療措施，因此預后不良，中位生存期約為6個月，2年生存率僅為10％，肺癌總的治愈率仍低于15%。,,二、個體化治療的要求,,無論手術，還是放化療等非手術治療，其總的五年生存率大約在10-20%左右,并且這個水平已達到了一個平臺。在臨床確診時，大多系中晚期患者，60-70%需要放化療，但是由于缺乏個體化的治療方案，總的療效較差。放射治療仍是中晚期非小

3、細胞肺癌的主要治療手段之一，但是有些患者療效較好，有些患者卻較差。因此通過基因、蛋白等分子生物學指標的檢測篩選最能夠從放化療中獲益的個體或人群，對于實現非小細胞肺癌個體化治療、提高個體療效至關重要。,三、目前放療界最熱門的研究,如何提高腫瘤細胞對放療的敏感性同時減少放射耐受（1）促凋亡基因（2）凋亡抑制基因,,研究顯示凋亡反應的提高提示細胞有更大的放射敏感性，增加凋亡反應的同時伴隨著細胞敏感性的增加現在有學者將誘導凋亡水平作為腫瘤放

4、射敏感性衡量指標。Lang FF,Yung WK,Raju U,et al.Enhancement radiosensitivity of wild-type p53 humanglioma cells by adenovirus-mediated delivery of the p53 gene.J Neurosurg, 1998, 89(1): 125-132.Kurdoglu B,Cheong N,Guan J,Corn

5、 BW, et al. Apoptosis as a predictor of Paclitaxel-induced radiosen sitization in human tumor cell lines.Clin Cancer Res, 1999, 5(9): 2580-2587.,,目前促凋亡基因的研究很多。但是對凋亡抑制基因在腫瘤放射耐受機理中的作用研究還非常少，尤其是目前最新發(fā)現的survivin，livin就更加不知

6、道他們在放射耐受機理中的角色,,四、假設與設想：,提高腫瘤細胞對放療的敏感性同時減少放射耐受可能的方法與途徑,,（1）首先能夠闡明凋亡抑制基因在腫瘤細胞固有的和放射誘導的放射耐受機制的作用（2）其次針對凋亡抑制基因這個靶點，干擾其活性,,致力于探索誘發(fā)細胞凋亡的方法，以期提高細胞對放射線的敏感性可能成為一種極具廣泛治療前景的新方法。研究發(fā)現許多人體基因均參與誘導腫瘤細胞凋亡的調控。其中誘導凋亡的基因有wtp53, c-myc, El

7、A, Apo-1/Fas, ced-3, ced-4等，而抑制凋亡的有bcl-2, mtp53, H-ras, ced-9和ElB等。其中尤以bcl-2及p53最引人注目，而bcl-2已被證明與細胞放射敏感性密切相關:其表達下調將導致細胞對射線的敏感性增加。,,調控細胞凋亡信號通路,作為腫瘤放療的增敏,根據細胞凋亡可調控的特點,利用生物治療辦法調控細胞凋亡信號通路,可以作為腫瘤放療的增敏劑,降低腫瘤細胞的放射誘導凋亡的閾值,克服腫瘤細胞

8、對放療誘導細胞凋亡的抗性并增強腫瘤放療效果已成為科研工作者的一個努力的方向。,五、前期的工作與進展,,越來越多的研究表明，細胞凋亡與細胞增殖一樣，同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床治療有密切的關系。放射治療作為腫瘤治療的重要手段之一, 其作用方式主要是通過損傷細胞的DNA , 影響細胞的增殖狀態(tài), 改變細胞周期的運行, 最終引起腫瘤細胞的增殖性死亡或凋亡。凋亡抑制基因可能正是在這些方面發(fā)揮作用從而導致腫瘤細胞的放療抵抗。,,survivin

9、 livin是凋亡抑制蛋白家族最近發(fā)現的新成員，他們在肺癌組織中的表達以及與肺癌細胞放射敏感性的關系報道甚少，他們在細胞固有的和放射誘導的放射耐受機制的作用沒有研究,尤其是livin還沒有這方面的報道。,,,Ling X等通過檢測24例NSCLC中survivin的兩個間接變構體survivin-2B 和survivin-△Ex3在的表達，發(fā)現survivin-2B高水平的表達與患者無復發(fā)和存活有關，相反survivin-△Ex3高水平

10、的表達與患者復發(fā)和死亡有關。與此一致，肺癌細胞株A549中survivin-2B能抑制細胞生長，誘導細胞凋亡，survivin-△Ex3則保護線粒體電位，促進細胞生長。從而認為survivin-2B 和survivin-△Ex3在NSCLC中有著相反的作用，為肺癌的治療提供了新的方向。Differential expression of survivin-2B and survivin-DeltaEx3 is inversely as

11、sociated with disease relapse and patient survival in non-small-cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer. 2005 Sep;49(3):353-61,,Survivin 與腫瘤放療抵抗的關系Survivin參與細胞固有的和放射誘導的放射耐受機制，抑制Survivin的mRNA表達可能會提高腫瘤對輻射的敏感性,,Rodel等對三種固有放射

12、敏感性不同的腸癌細胞株（低度敏感的sw480,中度敏感的HCT-15,高度敏感的sw48)用2和8Gy劑量照射后，集落形成結果顯示， sw48細胞株的自發(fā)和輻射誘導的凋亡水平均高于sw480細胞株，Western blot和RT-PCR結果顯示，Survivin在sw480細胞株中的自發(fā)和輻射誘導表達平均高于sw48細胞株， HCT-15居中。 Survivin表達水平與自發(fā)和輻射誘導的凋亡水平成反比，說明Survivin自發(fā)凋亡水平可

13、以作為體內直腸癌對放射治療的反應指標， Survivin的mNA和蛋白水平的測定可以預測直腸癌對放化療的敏感性,,A sanuma 等對5 個不同放射敏感性的胰腺癌細胞系進行研究后發(fā)現, 對X 線輻射抵抗最強的PANC-1 細胞株中survivin 的mRNA 水平最高, 說明檢測照射前的survivin mRNA水平可以預測其放射敏感性; 對PANC-1 和輻射最敏感的M IA PaCa-2 給予亞致死劑量照射后, survivin

14、mRNA 的表達水平都有顯著的升高, 伴隨caspase-3 的活性顯著下降, 與致死劑量照射后存活細胞中的表達相一致。這一結果說明, survivin 參與了細胞固有的和放射誘導的放射耐受機制, 抑制survivin 的mRNA 表達可能會提高胰腺癌對輻射的敏感性。A Sanuma K, Moriar, Yajima T, et al. Survivin as a radioresistance factor in pancreat

15、ic cancer [J ]. Cancer Res, 2000, 91(11) : 1204-1209.,,,Livin是最近發(fā)現的一個凋亡抑制基因，是IAP家族新成員。Livin基因位于人染色體20q13，全長4.6kb，包含7個外顯子，基因轉錄產物mRNA長1.4 kb。,,,Livin（ML-IAP/KIAP）主要在一些腫瘤組織細胞中高表達，是抑制腫瘤細胞凋亡的重要因素之一，但是其抗腫瘤細胞凋亡的作用還不明確，可能通過以下一些抗

16、細胞凋亡作用的途徑。,,,1.抗死亡受體介導的細胞凋亡作用：2.抗線粒體介導的細胞凋亡作用3.抗化療藥物介導的細胞凋亡作用,,,livin 是怎樣參與了細胞固有的和放射誘導的放射耐受機制,目前還不明確，沒有這方面的報道,,Uchida等[30]構建了一種由U6啟動子驅動的survivin siRNA腺病毒載體，將其分別轉染U251細胞、人宮頸癌HeLa細胞和人乳腺癌MCF-7細胞后，同樣觀察到survivin表達受到明顯抑制，腫瘤細

17、胞生長減緩，凋亡細胞增加。上述研究結果提示survivin可作為人類多種惡性腫瘤基因治療的一個潛在靶點， 研究表明,利用RNA 干擾技術,設計針對Livin的特異性siRNA 可以阻斷Livin 基因表達,并且可以增強腫瘤細胞對凋亡誘導劑的敏感性【31,32】。RNAi則有可能成為一種極具潛力的基因治療工具。,,中藥對細胞凋亡的影響多項研究表明從中藥中提取的一些有效成分對腫瘤生長有直接抑制作用，能阻止其代謝，降低其分裂增殖能力，下調凋

18、亡抑制基因表達、誘導腫瘤細胞凋亡，改變細胞周期分布。,,中藥通過細胞凋亡影響細胞放射敏感性苦參堿和欖香烯作為治療腫瘤的純中藥已廣泛應用于臨床，但是這些臨床報道并未探究他們作為一種放療增敏劑的增敏機制，本實驗旨在研究苦參，欖香烯對人肺癌細胞放射敏感性的影響:苦參，欖香烯是否增加人肺癌細胞的放射敏感性及不同濃度一時間作用后的增敏效果如何。并進一步探討他們的放射增敏的機制。為放射增敏臨床研究提供新思路和借鑒，為中藥放射增敏研究提供方法,,我

19、們自己的一些工作,,我們已經熟練掌握了細胞培養(yǎng)，RT-PCR, 熒光定量PCR,Westen Blot,，RNAi等多種分子生物學技術，以細胞培養(yǎng)為研究工具已經發(fā)表了多篇論文。,本研究中的三種細胞培養(yǎng)國內外均有文獻報道，技術成熟，本課題組已經熟練掌握。完成了江蘇大學臨床醫(yī)學科技發(fā)展基金《肺癌組織中凋亡抑制基因Livin與多藥耐藥的關系及臨床應用研究》，部分研究成果已經發(fā)表在Jpn J Clin Oncol. 2010 （SCI收入. ）

20、。,60例非小細胞肺癌組織survivin的表達PCR圖譜,,,60例非小細胞肺癌組織中 livin的表達PCR圖譜(圖 1),,,,,1，Survivin，livin蛋白在凋亡信號通路上的作用機理。Survivin ，livin表達水平是否與自發(fā)和輻射誘導的凋亡水平的關系密切，他們過表達，是否對自發(fā)和輻射誘導的凋亡可能有明顯的抑制作用，是否在肺癌細胞固有的和放射誘導的放射耐受中扮演重要角色。,六、研究目標和預期研究成果,2，Sur

21、vivin ，livin基因RNA干擾后，自發(fā)和輻射誘導的凋亡水平是否明顯增加，肺癌細胞固有的和放射誘導的放射抵抗是否減弱。Survivin ，livin可否作為肺癌等多種惡性腫瘤基因治療的一個潛在靶點，而RNAi則是否可能成為一種極具潛力的基因治療工具。,3，藥物對輻射干預：中藥苦參堿和欖香烯能否通過抑制凋亡抑制因子的表達，從而增加自發(fā)和輻射誘導的凋亡水平，減少放射誘導的放射耐受，增加腫瘤放射敏感性，獲得治療增益。為肺癌臨床的個體化治