基因突變引起遺傳密碼的改變

1、第五章基因結(jié)構(gòu)和表達變化與疾病的關(guān)系,基因結(jié)構(gòu)與表達異常與疾病,蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體各種生命現(xiàn)象和生命過程主要是通過蛋白質(zhì)的生理功能體現(xiàn)。疾病的本質(zhì)是由各種原因引起蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變的導(dǎo)致的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的紊亂。蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變從分子生物學(xué)角度講，又是基因結(jié)構(gòu)及表達的改變的結(jié)果，故基因結(jié)構(gòu)與表達的改變是疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制。,3,第一節(jié) 不同基因通過不同機制導(dǎo)致疾病發(fā)生,蛋白質(zhì)功能紊亂是疾病發(fā)生的基因病理機制

2、，但不同的基因通過不同機制引起蛋白質(zhì)功能紊亂。 基因結(jié)構(gòu)改變 環(huán)境因素影響了基因的表達 外源致病基因的進入表達：產(chǎn)生了毒性蛋白；產(chǎn) 生了合成非蛋白毒性物 質(zhì)的酶。,,一、基因結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)

3、致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或量變化引起疾病,由于體內(nèi)外各種因素改變了某基因特定的DNA序列堿基組成和排列順序，導(dǎo)致DNA一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變了基因結(jié)構(gòu)即基因突變。其分子機制可以是替換、插入或缺失，因而產(chǎn)生不同的突變類型。,(一) 基因突變的多種類型,點突變是單個堿基的改變：轉(zhuǎn)換和顛換缺失是一個或多個核苷酸的丟失插入是一個或多個核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)基因突變還分為配子突變與體細胞突變動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)序列（拷貝數(shù)）隨世代的

4、傳遞而改變。,,基因突變的類型,點突變:單個堿基的改變 在基因一級結(jié)構(gòu)的某個位點上，一種堿基被另一種堿基取代。,分為： 轉(zhuǎn)換 （transition） 顛換 （transversion）,基因突變的類型,缺失（delelation）是一個或多個核苷酸的丟失：在基因一級結(jié)構(gòu)中某個位點上，一個核苷酸或一段核苷酸序列丟失造成的基因結(jié)構(gòu)改變。,3. 插入（insertion）,基因突變的類型,倒位是一段核苷酸

5、序列方向倒轉(zhuǎn)：基因內(nèi)部的DNA序列重組，使一段DNA序列的方向倒轉(zhuǎn)。配子突變與體細胞突變動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變（dynamic mutation）,基因突變引起遺傳密碼的改變：根據(jù)基因突變產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)不同分為,(二) 不同的基因突變引起不同的遺傳效應(yīng),a. 同義突變 (consense mutation),b. 錯義突變 (missense mutation),c. 無義突變 (nonsense mu

6、tation),d. 移碼突變（frame-shifting mutation）,同義突變(same sense mutation)：密碼子發(fā)生改變, 但所編碼的氨基酸不變。,例如：CUU CUC CUG → 亮氨酸,錯義突變（missense mutation） 指DNA分子中堿基的取代，經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA后，相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸組成和排列順序發(fā)生改變。,由于堿基

7、的取代、缺失或插入，使原來編碼某種氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子的基因突變叫無義突變 (nonsense mutation) 。,亮氨酸的密碼子UUA，中間的U變?yōu)锳這樣一個堿基變化就會成為（終止密碼子）UAA。,酪氨酸的密碼子是UAC，置換突變使UAC變?yōu)槊艽a子UAG后翻譯便到此停止。,無義突變：,指DNA鏈上插入或丟失1個、2個甚至多個堿基（但不是三聯(lián)體密碼子及其倍數(shù)），在讀碼時，由于原來的密碼子移位，導(dǎo)致在插入或丟失堿基部位以后

8、的編碼都發(fā)生了相應(yīng)改變。移碼突變造成的肽鏈延長或縮短，取決于移碼終止密碼子推后或提前出現(xiàn)。,移碼突變(frame-shift mutation),(2) 基因突變影響 hnRNA 的剪接,基因突變發(fā)生在 hnRNA 的一級結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點上，導(dǎo)致 hnRNA 的剪接錯誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達產(chǎn)物，改變生物性狀。,(三) 結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病,1. 血紅蛋白病 (hemoglobinopath

9、y)： 血紅蛋白(hemoglobin, Hb)的結(jié)構(gòu)特點 珠蛋白(globin)基因的時、空特異性表達,血紅蛋白結(jié)構(gòu),血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個α和兩個β鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個血紅素。,血紅蛋白的脫氧（T）和氧合（R）構(gòu)象在氧的親和性方面有很大區(qū)別。由于結(jié)構(gòu)上的相互作用是與它的三級和四級結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以血紅蛋白在結(jié)合氧的過程中顯示出別構(gòu)效應(yīng)和協(xié)同性。,血紅蛋白分子一級結(jié)構(gòu)上的輕微差別就可能導(dǎo)致功能

10、上的很大不同，正常成年人血紅蛋白中的β鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會導(dǎo)致鐮刀形細胞貧血病的異常血紅蛋白HbS 的生成。,血紅蛋白病——鐮刀形細胞貧血癥,血紅蛋白病類型,異常血紅蛋白: 珠蛋白結(jié)構(gòu)(質(zhì))變異，導(dǎo)致貧血。,地中海貧血: 珠蛋白合成(量)減少，又稱珠蛋白合成障礙性貧血。,20,四、基因調(diào)控序列變異導(dǎo)致表達水平變化引起疾病,通過對β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列研究，發(fā)現(xiàn)這些調(diào)控序列如發(fā)生基因突變，就會降低β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水

11、平， β珠蛋白合成減少，引起β型地中海性貧血。除了調(diào)控序列改變會影響相應(yīng)基因的表達外，基因內(nèi)的內(nèi)含子變異也會影響蛋白質(zhì)合成。,二、細胞間信號異常導(dǎo)致基因表達異常引起疾病,人體各細胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號等保持細胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝?；虮磉_也受到細胞間信號的調(diào)控。通過細胞間信號傳遞，能保證基因表達的時間特異性和空間特異性以及表達水平正常。AFP 是胚胎發(fā)育過程中表達的蛋白，具有免疫抑制作用，保護胎兒免受母體免疫攻擊

12、。在接受異常的細胞增殖信號作用下，其基因表達，導(dǎo)致肝癌細胞逃避機體免疫監(jiān)視。成為肝癌發(fā)生的重要因素。,三、細胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因表達異常引起疾病,異常的細胞內(nèi)信號導(dǎo)致基因表達異常引起疾病 高血糖 → DAG↑ → ⊕PKC → ⊕ ACE → AngⅡ ↑,異常的DNA甲基化導(dǎo)致基因表達異常引起疾病 hCG5‘轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化→非滋養(yǎng)層細胞hCG ↑ →受體結(jié)合→ ⊕cAMP信號途徑 →調(diào)節(jié)其它生長因子產(chǎn)生，促進Tumor形成

13、 ↑,,刺激蛋白質(zhì)合成,,心肌肥大,23,四、病原生物基因的體內(nèi)表達,1、外原病原生物進入人體內(nèi)，大量繁殖，生長，引起機械或生物學(xué)損傷2、與人體爭奪營養(yǎng)，引起疾病3、產(chǎn)生生物毒素作用人體，引起疾病4、外源基因的整合到人基因組上，引變了一些基因結(jié)構(gòu)或表達。,二、基因結(jié)構(gòu)和表達與疾病的研究策略,1．通過結(jié)構(gòu)分析確定基因變異 核糖核酸酶切分析、雜合雙鏈分析、 化學(xué)切割錯配、酶促切割錯配,3．通過功能學(xué)研究確定致病基因

14、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、 反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達,2．基因表達水平分析 差異顯示、抑制消減雜交、基因表達系列分析,核糖核酸酶切分析,基本原理: 在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯配堿基可被核糖核酸酶RNase識別并切割，通過凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯配的位置。,核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）,缺點：當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，核糖

15、核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一條鏈，突變檢出率為 30%；同時分析DNA的兩條鏈，突變檢出率為 70%；需要制備特異性的RNA探針,雜合雙鏈分析法 （heteroduplex analgsis, HA）,直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成單鏈環(huán)形突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)同源雙鏈DNA不同的遷移率。

16、 檢測缺失突變只適于200-300bp長度片段,且不能確定位置,檢出率只有80%.,化學(xué)切割錯配法 （Chemical cleavage of mismatch, CCM）,基本原理： 將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺和哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。,化學(xué)切

17、割錯配法,特點：突變檢出率高；如使用熒光檢測系統(tǒng)，靈敏度較高；可檢測長度達 2Kb的核酸片段；步驟多、費時、有毒；如對正義鏈與反義鏈都進行分析,檢測率達100%.,酶促切割錯配 (enzyme mismatch cleavage ),酶促切割錯配是一種與Rnase酶切分析相類似的方法.不同之處是該方法采用的酶是T4核酸內(nèi)切酶Ⅶ能夠識別12種錯配的堿基,并在錯配堿基附近進行酶切.優(yōu)點:對檢測DNA片段可用DNA探針雜交檢測

18、.最長檢測長度達到1.5Kb.缺點:可出現(xiàn)非特異性切割,對錯配認別也不是100%.,RFLP--Restriction Fragment Length Polyhmorphism,RFLPs,Microsatellite repeats,35,二、通過基因表達水平分析確定基因在疾病發(fā)生中作用,人類疾病發(fā)生的另一個重要原因是基因表達水平的改變，因基因表達水平的改變涉及的往往不是單一基因，而是多基因，即一些基因表達增加，一些基因表達降

19、低，導(dǎo)致由其編碼蛋白組成的代謝及調(diào)節(jié)系統(tǒng)異常，引發(fā)疾病。因此通過基因水平找到正常與疾病狀態(tài)下的差異表達基因，確定其在疾病中作用。方法：Northern雜交法，消減雜交技術(shù)、差異顯示法、定量RT-PCR、基因表達芯片等．,差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR),在不同的生長時期、在個體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物

20、體對疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達是不同的，這就是基因的差別表達（differential expression）。,,原理：利用兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增。3’端引物：利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾巴之前的兩個堿基只有12種可能的排列組合：,,根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由11~12個T及兩個其它的堿基組成，

21、用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。5’端引物：5’端為10個堿基（10-mer）組成的隨機引物。每一個隨機引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點也可能在mRNA的不同位點上。用一種3’錨定引物和一種5’隨機引物進行擴增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡

22、可能多的5’隨機引物。,抑制性差減雜交 (SSH) --- Diatchenko L, et al. PNAS 1996; 93:6025-6030Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries,抑制性差減雜交

23、 (suppressive subtractive hybridization, SSH)原理 SSH是差減雜交與PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。運用雜交動力學(xué)原理，豐度高的單鏈DNA退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；抑制PCR利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結(jié)構(gòu), 無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基

24、因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。,,方法提取實驗組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別 4 堿基的限制性內(nèi)切酶切割實驗組cDNA平均分為2份，分別連接2個接頭進行2輪差減雜交和抑制性PCR獲得富集的目的基因,,,,抑制性 差減雜交 (SSH) 流程圖,,,,,,,檢測組 (Tester) — 含目的基因cDNA，加接頭驅(qū)逐組 (Driver) — 不含目的基因cDNA，不加接頭 * 接頭

25、含PCR 引物正向SSH: 易感者(Tester) + 不易感者(Driver) 易感者特異表達或高表達基因 反向SSH: 不易感者(Tester) + 易感者(Driver) 不易感者特異表達或高表達基因,,,抑制性差減雜交(SSH),,優(yōu)點 采用兩次差減雜交和PCR，保證了高特異性 (假陽性率可降至6％); 在雜交過程中可使不同豐

26、度基因均衡化，獲得低豐度差異表達基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法缺點 起始材料需要 ?g 級量mRNA; SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度,抑制性差減雜交(SSH),Elkeles A,et al. Mol Cell Biol 1999; 19: 2594-2600 The c-fos proto-oncogene is a target for transactivation by the

27、 p53 tumor suppressor 采用SSH法證實, 在p53介導(dǎo)的細胞凋亡過程中，c-fos是p53轉(zhuǎn)錄刺激的靶基因,從而提供了這兩種重要調(diào)控蛋白相互作用的直接依據(jù),抑制性差減雜交(SSH),Kostic C and Shaw PH. Oncogene 2000; 19:3978-3987Isolation and characterization of sixteen novel p53 response gen

28、es通過SSH比較了p53缺失和含p53的結(jié)腸癌細胞株間基因差異表達，發(fā)現(xiàn)16個p53依賴的下游靶基因,抑制性差減雜交(SSH),基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE),是一種用于定量、高通量基因表達分析的實驗方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分離每個轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標簽（約9-14個堿基對），這些短的序列被連接、

29、克隆和測序，特定的序列標簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)基因的表達豐度。,Serial analysis of gene expression (SAGE) 技術(shù)流程,轉(zhuǎn)基因技術(shù),指在生物基因組中帶有插入或整合入的外源基因，生物個體能將它一傳給后代，并表達出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。,Transgenic Animal,Animal in which a segment of DNA has been physicall

30、y inserted into the genome.The genome of all cells of the organism contains the DNA segment.The DNA segment is present in the germ line so it can be transmitted to progeny as a Mendelian trait.,Retroviral Mediated Ge

31、ne Transfer,,,,,,,,,,MoMuLV Producing Cells,,Mouseembryos,Insertion of viral DNA containingtransgene into embryos,,,Transgenic Mouse,,,,,,,,,,,,,,,,,X,,1-cell pronuclear stagemouse embryo.,PMS + HCGto superovulate,,,

32、,,? Pregnant Foster Mother,,,,,,,,,,Oviduct Transfer,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,+,,,,,,,2-cell stage embryo,Holding Pipette,,,,,,Injection Pipette,,,基因敲除（Knock out）,Step

33、1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray fur.,Step 2. Remove embryonic stem cells from gray-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture.,Step 3. Transfect st

34、em cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and GCV.,Step 4. Remove homologously recombined stem cells from petri dish and inject into a new

35、blastocyst that would have only white fur.,Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white fur mouse.,Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but o

36、thers will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produc

37、e gray patches which are easily detected.,Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. E

38、very cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination.,Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a

39、strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a "knockout mouse".,knockout mouse,核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用,1. RNA分子，催化核糖體RNA中內(nèi)含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，還可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA鏈的復(fù)制等。2. 優(yōu)點:其底物的堿基配

40、對特異性。核酶與底物結(jié)合常形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或“錘頭”結(jié)構(gòu)。3. 設(shè)計核酶特異性地結(jié)合于靶點，以其本身酶活性進行剪切。,What is RNAi ?,RNA干擾（RNA interference，RNAi）內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。,RNAi 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),,線蟲（C. elegans),(Fire, 1998),+,Par-1 Gene Disru

41、ption,Expression,,Down,,,Double Strand RNA,線 蟲， 果 蠅微生物， 植 物,,dsRNA,Dicer cleavage of dsRNA,siRNA,,,,,RNAi 抑制基因表達的機理,Cell Membrane,,RNA干擾(RNA interference, RNAi) RNAi 是將一段雙鏈的RNA 序列導(dǎo)入機體或細胞中,機體或細胞中與之有同源序

42、列的基因的表達將會受到抑制,甚至表達受到完全抑制,基因誘導(dǎo)超表達技術(shù)確定基因在疾病中的作用,將目的基因全長序列與高活性啟動子或組織特異性啟動子融合，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)劑的作用下或在特定的組織細胞中，目的基因超表達，相應(yīng)的基因表達產(chǎn)物大量積累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。,三、疾病相關(guān)基因的功能克隆和定位克隆,1． 疾病相關(guān)基因2． 功能克隆3． 定位克隆,疾病相關(guān)基因與疾病,單基因病 (一

43、個基因位點上的缺陷)多基因病 (涉及兩個以上的基因位點)染色體病 (染色體結(jié)構(gòu)與數(shù)目的改變)獲得性基因病 (遺傳易感性或病原微生物),功能克隆(Functional cloning),以獲得的蛋白質(zhì)表達及功能信息為線索，分離鑒定出相應(yīng)的基因，叫未知基因的功能克隆。,基因克隆（gene cloning)功能克?。?functional cloning） --- 根據(jù)特異蛋白質(zhì)分離目的基因的策略表型克?。?

44、phenotype cloning ） --- 根據(jù)特異mRNA 分離目的基因的策略,,,,功能克隆 　氨基酸序列　　核苷酸序列　　PCR特異蛋白質(zhì) 　 目的基因 　抗體 　基因文庫篩選評價優(yōu)點 -- 在單基因

45、性狀的基因分離方面仍為常用策略缺點 -- 特異蛋白質(zhì)確定、鑒定及其純化困難* -- 難以分離微量表達基因 -- 無法研究無蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因 -- 難以進行多基因控制性狀的基因分離,,,,,,,,,通過蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)分離鑒定未知基因,基因轉(zhuǎn)錄后在核糖體上翻譯合成蛋白質(zhì)，形成核糖體-mRNA-蛋白質(zhì)產(chǎn)物部分氨基酸序列的復(fù)合體，運用抗體與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫共沉淀反應(yīng)，可以分離此復(fù)合體，進而分離到mRNA，最

46、終克隆到未知基因。,西紅柿女孩一女孩患苯丙酮尿癥，不食“人間煙火”，僅能吃西紅柿。智力發(fā)育不全、嚴重的嘔吐，皮膚、毛發(fā)顏色變淺，虹膜顏色減退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸飲食治療。,定位克隆,又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于20世紀80年代后期利用遺傳連鎖或細胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進一步研究

47、其功能。,,疾病,遺傳標記，染色體定位,基因序列,mRNAcDNA,蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功能,疾病,基因,功能,,定位克?。和ㄟ^遺傳標記 ，先獲得某一表型基因在染色體上的定位 ，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進行致病突變的篩選 ，并獲得cDNA及全基因。 基本思路是通過連鎖分析原理進行基因定位。 若多態(tài)標記與待定基因距離較遠 ，則它們在向子代傳遞時會發(fā)生自由分離 ，呈“連鎖平衡”；反之 ，則不發(fā)生自由分離 ，而

48、呈現(xiàn)“共分離”現(xiàn)象 ，即“連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定位與某一DNA標記相連鎖的基因。,將基因定位于染色體 特定區(qū)段2. 候選基因篩選鑒定,定位克隆的主要步驟之一是將目標基因定位于特定染色體上。 主要方法： 家系遺傳調(diào)查分析法、染色體斷裂點分析 （家系選擇、分離分析、連鎖分析） 體細胞雜交法 核酸雜交技術(shù) 突變分析技術(shù),家系遺傳分析法,選擇一個含有40多個能提供信

49、息的減數(shù)分裂事件的三代以上 的家系，要排除家系的異質(zhì)性；除了對照基本遺傳表型的各種表現(xiàn)型的幾率外，還要考慮外顯不全；以數(shù)學(xué)計算機模型模擬分析；選擇一定的遺傳標記，進行基因分型，確定疾病基因在染色體上的位置。,基因連鎖分析,連鎖分析主要是應(yīng)用限制酶片段長度多態(tài)性（ RFLP ）為遺傳標志進行家系分析在人類基因組中，平均約 200 bp可發(fā)生一對變異 （稱為中心突變 ）中心突變造成了序列上的多態(tài)性，不少序列多態(tài)性發(fā)生在限制酶識別位點

50、上，產(chǎn)生了限制酶酶切位點的多態(tài)性用該限制酶水解 DNA就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱RFLP。,定位候選克隆,該方法是定位克隆的進一步發(fā)展將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干候選基因進一步分析得到目的cDNA蛋白質(zhì)功能研究,,疾病,染色體定位,若干候選基因,確定目的基因,蛋白質(zhì)功能,,cDNA篩選　染色體定位只是定位克隆的其中一步。由于ｃDNA篩選、確認的困難 ，是定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法

51、大致有:(1)對 < 500kb 的關(guān)鍵部位進行直接測序；(2)比較基因組作圖和測序； (3)基因結(jié)構(gòu)特征分析； (4)cDNA捕獲，主要有ＣpG島捕捉層析法、 外顯子捕捉法、直接篩選PCR法等方法,cDNA篩選,直接法：用基因組DNA直接從cDNA文庫中篩選位于該基因組片段內(nèi)的cDNA。選擇法：將基因組DNA固定在膜上，與總cDNA或cDNA文庫的PCR產(chǎn)物雜交，找到能雜交到膜上的cDNA片段，再用PCR擴增這

52、些cDNA片段。,通過EST拼接,如：已知小鼠某基因在人當(dāng)中有高度同源序列用該小鼠cDNA比對人的EST數(shù)據(jù)庫得到一簇EST后，將相鄰的EST通過相互重疊部分進行拼接。得到人對應(yīng)的完整cDNA的序列后，兩端設(shè)計引物在cDNA文庫中進行PCR，得到該cDNA的克隆。至此，與小鼠對應(yīng)的人的該基因得以克隆出來。,基因芯片技術(shù)的應(yīng)用,使用傳統(tǒng)方法尋找新基因，不僅需要投入大量的資金，而且針對性不強，效率低下，大部分工作繁瑣重復(fù)。通過基

53、因芯片分析正常組織和疾病組織基因表達情況的差異，往往能夠從那些表達異常的基因中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。,四、HGP與疾病相關(guān)基因的研究,隨著人類基因組草圖測定的完成，宣告了“ 后基因組時代 ”的到來。功能基因組學(xué)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。,同一種細胞或組織，處于不同的狀態(tài)（生理與病理等），發(fā)育的不同階段，受到外界的不同影響時，都可能使細胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而產(chǎn)生不同的蛋白

54、質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)注和研究的就是這些變化。,研究蛋白質(zhì)與疾病相互關(guān)系的方法,ELISA免疫印跡免疫沉淀蛋白質(zhì)親和層析毛細管電泳,噬菌體展示技術(shù),絲狀噬菌體基因,建 庫,篩選,核糖體展示 (ribosome display),核心是利用體外核糖體表達載體構(gòu)建 sc Fv抗體庫 ,并于體外轉(zhuǎn)錄為 m RNA, 體外翻譯表達 , 隨后以固相化的抗原分子親和篩選出核糖體 -m RNA-sc Fv復(fù)合物中的高親和力 sc Fv。這種技術(shù)

55、在實驗中不用任何細胞 ,是第一個完全在體外篩選有功能蛋白的方法。,特點,不需轉(zhuǎn)化細菌或真核細胞 避免了宿主隨細胞基因組復(fù)制過程中可能丟失而產(chǎn)生的庫 容下降 , 亦解決了因抗體篩選條件不利于宿主細胞生存而導(dǎo)致抗體丟失這一難題。由于核糖體展示技術(shù)的體外翻譯、體外篩選的特點 , 大大縮短了實驗周期 , 具有省時省力、方便快速的特點。,蛋白質(zhì)組分離技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù),雙向凝膠電泳技術(shù)(2DE)：又稱二維電泳，其原理是在相互垂直的兩

56、個方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點和分子量，運用等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，把復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白在二維平面上分離展開。完整的雙向凝膠電泳分析，包括樣品制備、等電聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、SDS—PAGE、斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟。,雙向凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用,用于分離細胞或組織蛋白質(zhì)粗提物構(gòu)建特定組織或細胞的蛋白質(zhì)“二維參考圖譜”；分析特

57、定時間與病理、生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達情況，進行蛋白質(zhì)組差異比較。已構(gòu)建特定組織或細胞的蛋白質(zhì)2DE圖譜數(shù)據(jù)庫不同生物、不同器官、組織、細胞的專一性2DE數(shù)據(jù)庫，為實現(xiàn)對已知蛋白質(zhì)的分析鑒定、未知蛋白的發(fā)現(xiàn)、總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的規(guī)律以及實現(xiàn)模擬與預(yù)測等奠定了基礎(chǔ)。,1．疾病的蛋白質(zhì)組研究 （1）腫瘤蛋白質(zhì)組研究 （2）心血管疾病蛋白質(zhì)組研究 （3）神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究 2．病原微生物的蛋白質(zhì)組研究 3．蛋白質(zhì)組藥物開發(fā)

58、,生物信息學(xué)主要研究領(lǐng)域,⑴ 建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫①核酸序列數(shù)據(jù)庫②三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫⑵基因組序列信息的提取和分析①序列比對（Alignment）和結(jié)構(gòu)比對②蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測③蛋白質(zhì)編碼基因的計算機輔助識別④非編碼區(qū)分析和DNA語言研究⑤ 分子進化和比較基因組學(xué) 、遺傳密碼的起源⑥ 序列重疊群（Contigs）的裝配⑶生物大分子結(jié)構(gòu)模擬及其與疾病、藥物設(shè)計⑷ DNA芯片和微陣列的發(fā)展,建立和管理各種生物信息數(shù)據(jù)庫

59、,各種生物數(shù)據(jù)庫的建立是一切生物信息學(xué)工作的基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)的主要內(nèi)容，各種數(shù)據(jù)庫幾乎覆蓋了生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。如EBI的SRS(Sequence Retrieval System)包含了核酸序列庫、蛋白質(zhì)序列庫，三維結(jié)構(gòu)庫等30多個數(shù)據(jù)庫及CLUSTALW、PROSITESEARCH等強有力的搜索工具，用戶可以進行多個數(shù)據(jù)庫的多種查詢。,生物信息數(shù)據(jù)庫,核酸序列數(shù)據(jù)庫Genbank，美國國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)庫（htt

60、p://ncbi.nhm.nlm.gov）。 EMBL，建立在歐洲分子生物實驗室的數(shù)據(jù)庫 (http://www.embl-heidelberg.de)。DDBJ，日本的DNA數(shù)據(jù)庫銀行（http://www.nig.ac.jp )。與基因組有關(guān)的數(shù)據(jù)庫還有 ESTdb, GDB, GSDB OMIM (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim/) ，EBI的SRS（sequence retri

61、eval system）使用戶可以進行多個數(shù)據(jù)庫的多種查詢。,蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫有SWISS-PROT http://www.ebi.ac.uk/swissprot/, PIR http://pir.georgetown.edu/ , OWL, NRL3D, TrEMBL等蛋白質(zhì)片段數(shù)據(jù)庫有PROSITEhttp://www.expasy.ch/prosite/ , BLOCKS, PRINTS等SCOP http://www.ip

62、c.pku.edu.cn/scop/, CATH, FSSP, 3D-ALI, DSSP等,與疾病的關(guān)系研究  基因多態(tài)性分析 即使一個基因的序列已經(jīng)確定，它只是有代表性的序列之一，在群體分布中，仍存在有基因的多態(tài)性。正是由于多態(tài)性的存在，生物表型及對環(huán)境、外源物和藥物的反應(yīng)即不同。研究基因多態(tài)性可以對群體的基因共性及其中的基因個性( SNPs)都有明確的認識。 基于遺傳的流行病學(xué)研究

63、 流行病學(xué)研究是醫(yī)學(xué)信息學(xué)的重要課題之一。將流行病學(xué)的遺傳和非遺傳性的研究與分子基因信息結(jié)合起來，會導(dǎo)致對疾病的機理、個體對某種疾病的易感性和疾病在群體中的分布有更明確的認識，對疾病的預(yù)防和治療有極大的指導(dǎo)意義。,單基因病的研究,蛋白質(zhì)二維電泳：,蛋白質(zhì)提取,,樣品前處理,,一向等電聚焦,,,,二向SDS—PAGE,,凝膠銀染及掃描,,,雙向電泳分析軟件分析,,差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)普分析,,,生物信息數(shù)據(jù)查詢、建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,功能基因

64、組和蛋白質(zhì)組,,基因序列,,編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測,,,基于結(jié)構(gòu)的同源模建,基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識,基因功能預(yù)測,,藥物先導(dǎo)化合物的開發(fā),潛在靶標的識別,,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)作業(yè),以所學(xué)分子生物學(xué)知識為基礎(chǔ),試述一種與基因有關(guān)的疾病。（小綜述）要求：文稿 論點明確、資料可靠，層次清楚。1500－2000字，小四號字（行距1.5）A4 打印; 可有插圖和圖表。可交電子版(Word 或 PPT 格式)。文題自擬，署班級、作者姓名；參考文獻不少于3