重要的食品檢驗(yàn)

1、沙門氏菌及其檢驗(yàn),一、沙門氏菌簡介二、案例分析三、檢驗(yàn),沙門氏菌屬（Salmonella）是腸桿菌科的一個大屬，有2600多個血清型，我國發(fā)現(xiàn)的約有100個。沙門氏菌廣泛存在于豬、牛、羊、家禽、鳥類、鼠類等多種動物的腸道和內(nèi)臟中。 本屬細(xì)菌絕大多數(shù)成員對人和動物有致病性，能引起人和動物的敗血癥與胃腸炎，甚至流產(chǎn)，并能引起人類食物中毒，是人類細(xì)菌性食物中毒的最主要病原菌之一。,沙門氏菌及其檢驗(yàn),致病性最強(qiáng)的是豬霍亂沙門氏菌(Sa

2、lmonella cholerae)，其次是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)。,沙門氏菌及其檢驗(yàn),在食品衛(wèi)生上，認(rèn)為沙門氏菌所有血清型均對人類存在致病性，因此要求所有食品中均不得檢出。,生物學(xué)特性1.形態(tài)染色特性G-無芽孢桿菌。菌端鈍圓，散在，無莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外均有周身鞭毛，能運(yùn)動，絕大多數(shù)菌株有菌毛。,沙門氏菌簡介,

3、生物學(xué)特性1.形態(tài)染色特性2.培養(yǎng)特性需氧或兼性厭氧菌。對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長旺盛。膽鹽可促進(jìn)其生長。,沙門氏菌簡介,生物學(xué)特性1.形態(tài)染色特性2.培養(yǎng)特性§普通瓊脂：圓形、光滑、 無色半透明、中等大小(2 ~ 4mm)菌落。雞白痢、雞傷寒、豬副傷寒、甲型副傷寒沙門氏菌等只能長成細(xì)小菌落。§麥康凱瓊脂和伊紅美蘭瓊脂（EMB）：菌落無色半透明§Ｓ.Ｓ瓊脂和ＤＨＬ瓊脂：無色半透明

4、、中心黑色或幾乎全部黑色（多數(shù)菌株）的菌落§ＨＥ瓊脂：形成藍(lán)綠色或藍(lán)色菌落，產(chǎn)硫化氫菌株菌落中心帶黑色。,沙門氏菌簡介,S.typhimurium. HE,Salmonella Typhi　SS，無色Salmonella Enteritidis　SS，黑色(H2S)Escherichia coli ATCC25922　SS，粉紅色,3.生化特性　沙門氏菌屬細(xì)菌一般生化特性硫化氫 + 枸櫞

5、酸鹽利用 d 甘露醇 +尿素酶 - 賴氨酸脫羧酶 + 棉子糖 -靛基質(zhì) - 精氨酸雙水解酶 （+） 鼠李糖 +M.R. + 鳥氨酸脫羧酶 + 蔗糖

6、 -V-P - 苯丙氨酸脫羧酶 - 衛(wèi)矛醇 +KCN - 分解葡萄糖產(chǎn)氣 + 丙二酸鈉 -動力 + 側(cè)金盞花醇 - 明膠（22℃） -水楊苷 -

7、 氧化酶 - 乳糖 - O/F試驗(yàn) 發(fā)酵型 注：+ 陽性；- 陰性；d 有不同的生化型；（+） 遲緩陽性,,,生物學(xué)特性1.形態(tài)染色特性2.培養(yǎng)特性3.生化特性4．血清學(xué)特性沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般沙門氏菌具有菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和包膜抗原

8、 (Vi抗原) 等三種抗原。1）O抗原（菌體抗原）沙門氏菌的O抗原共有65種，以阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3、4……代表．凡含有共同O抗原組分的各個血清型劃歸于一個群。目前有58個血清群。 2）H抗原 63種 3） Vi抗原 為包膜抗原,沙門氏菌簡介,生物學(xué)特性5、抵抗力沙門氏菌屬不耐熱，55℃ 1h、60℃ 15~30min即被殺死。但在水中、各種食品中以及冷凍條件下存活時間較長。由于沙門氏菌屬不分解蛋白質(zhì)，不產(chǎn)生

9、靛基質(zhì)，污染食物后無感官性狀的變化，易被忽視而引起食物中毒。,沙門氏菌簡介,二、案例淺析,,,,,,,,,,,,,,原因食品： 主要為動物性食品，特別是畜肉類及其制品，其次為禽肉、蛋類、乳類及其制品，由植物性食品引起者很少。 國內(nèi)報道，豬的帶菌率為10.7～34.8%，雞的帶菌率為2.3～6.8%，雞蛋帶菌率高達(dá)30%。國外，如荷蘭報道豬的帶菌率在30.1% 以上。 沙門氏菌食物中毒發(fā)病率較

10、高，占總食物中毒的40％~60％，最高可達(dá)90％。,,,檢驗(yàn) 食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法，應(yīng)按《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)——食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)方法》(GB/ T4789. 4—2003)進(jìn)行。主要程序： 前增菌和增菌 分離 生化試驗(yàn) 血清學(xué)分型鑒定（O、H、Vi抗原的鑒定） 結(jié)果報告,

11、沙門氏菌及其檢驗(yàn),,前增菌冷凍的肉類、蛋制品、乳制品等加工食品。方法是將樣品25g（mL）用緩沖蛋白胨水（BP）225mL勻漿后于37℃培養(yǎng)4h。選擇性增菌——MM（TTB）及SC前增菌后的樣品。取10mL加入到100mL選擇性增菌液中培養(yǎng)18～24h。 鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)過加工的食品、病人樣品等。可直接取樣品25g（mL）用鹽水混勻，并用MM（TTB）及SC進(jìn)行選擇性增菌。,,細(xì)菌分離與菌落挑選 1. 取上述增

12、菌培養(yǎng)物分別劃線接種于BS瓊脂平板和DHL（或HE或SS）瓊脂平板各一個，經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h（DHL、HE、SS）或40~48h（BS），觀察菌落形態(tài)。2. 挑選可疑菌落3～5個接種于三糖鐵（TSI）瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)18—24h。,根據(jù)三糖鐵（TSI）上的反應(yīng)結(jié)果判斷斜面 底層 產(chǎn)氣 H2S 可能的菌屬和種- + +/- + 沙門

13、氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸菌、 變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌+ + +/- + 沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、 普通變形桿菌- + + -

14、 沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌屬、蜂 窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌、普羅菲 登斯菌屬- + - - 傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏

15、 菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞 菌、摩根氏菌、普羅菲登斯菌屬+ + + - 大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏 菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地

16、氏檸檬酸 桿菌,,,,,Triple Sugar Iron agar slant (TSI slant),Use : For the differentiation of members of the Entero-bacteriaceae base on their fermentation of lactose, sucrose and g

17、lucose and the production of H2S.,生化檢驗(yàn)結(jié)果判斷：如果H2S+、KCN-、尿素-、靛基質(zhì)-、賴氨酸+為沙門氏菌典型反應(yīng)；若其中尿素、KCN和賴氨酸3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，仍可判為沙門氏菌；若有2項(xiàng)異常，則判為弗勞地氏檸檬酸桿菌；若靛基質(zhì)+，應(yīng)補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，若均為陽性，則判為沙門氏菌的變異；若均為陰性，則為緩慢愛德華氏菌。若H2S-補(bǔ)做ONPG，ONPG+為大腸埃希氏菌，ONPG-

18、為沙門氏菌。凡臨床分離菌乳糖、吲哚陽性或脲酶陽性者，均不考慮為沙門菌。,,血清學(xué)鑒定 由于引起人和動物發(fā)病的沙門氏菌絕大多數(shù)分布于A—F群中，所以通常只需做A—F群O抗原成分和H抗原鑒定即可判定沙門氏菌的血清型。（1）O抗原鑒定：首先用市售A-F多價抗O血清做玻片凝集試驗(yàn)。出現(xiàn)凝集后，再用代表9個O群的O因子血清，逐一檢查，以確定待檢菌屬于哪個O群。 O多價1 A，B，C，D，E，F(xiàn)群（并包括6，14群）O

19、多價2 13，16，17，18，21群O多價3 28，30，35，38，39群O多價4 40，41，42，43群O多價5 44，45，47，48群O多價6 50，51，52，53群O多價7 55，56，57，58群O多價8 59，60，61，62群O多價9 63，65，66，67群,,血清學(xué)鑒定 （2）H抗原鑒定：一般最好使用63種規(guī)格診斷血清中的8個H多價血清來檢查，

20、方法類似于O抗原鑒定， （3）Vi抗原鑒定：用Vi因子血清檢查。,,檢驗(yàn) 沙門氏菌的快速檢驗(yàn)方法： 1．熒光抗體法（以前列入進(jìn)出口檢驗(yàn)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)） 2．E-15快速生化鑒定系統(tǒng)檢查法 3．噬菌體裂解法 4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、DNA探針技術(shù)、PCR技術(shù)等,沙門氏菌及其檢驗(yàn),,金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)Examination of Staphylococcus aureus,S.

21、aureus 1000x,S. aureus cells attaching to, and invading, epithelial cells,葡萄球菌,葡萄球菌（Staphylococcus）是引起人類和動物化膿性感染的最重要病原菌，可引起人類丘疹、癤、膿腫、骨髓炎和腦膜炎以及奶牛的乳房炎，又是引起人類食物中毒的最常見細(xì)菌之一。 葡萄球菌包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 、表皮葡萄球菌(sta

22、phylococcus epidermidis)和腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)。引起食物中毒的主要是金黃色葡萄球菌，致病因素是其在食品中繁殖后產(chǎn)生的腸毒素(enterotoxin)，故屬于毒素型中毒。 中毒的原因食品主要是乳類、肉類、魚類及含淀粉高的食物（如剩米飯等），特別是經(jīng)過加熱處理的食品。,,1. 形態(tài)染色特性 革蘭氏陽性球菌，致病性菌株形態(tài)較小，呈葡萄串狀排列。無芽孢，

23、無鞭毛，一般不形成莢膜。2. 培養(yǎng)特性 兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基上生長良好。金黃色葡萄球菌在血平板通常產(chǎn)生金黃色色素，多數(shù)溶血。在普通肉湯中培養(yǎng)24h后，均勻渾濁生長；2~3天后可形成菌膜；老齡培養(yǎng)物管底可有粘稠沉淀物。耐鹽性強(qiáng)，在含10％ ～15％氯化鈉培養(yǎng)基中亦能生長。,一、金黃色葡萄球菌簡介,,,1. 形態(tài)染色特性2. 培養(yǎng)特性普通瓊脂上：濕潤、不透明的中等大小菌落，直徑一般為1~2mm。Baird-Parke

24、r氏瓊脂上：菌落為圓形、光滑、凸起、濕潤，直徑為2~3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣色淡，周圍為一渾濁帶，其外層有一透明帶。,一、金黃色葡萄球菌簡介,,,菌落完全溶血,Characteristic gold/yellow colonies of penicillin-resistant Staphylococcus aureus,一、金黃色葡萄球菌簡介,葡萄球菌不同菌株在固體培養(yǎng)基產(chǎn)生不同的顏色，從而分為金黃色葡萄球菌，白色葡萄球菌、檸檬

25、色葡萄球菌。,Staphylococcus aureus on Mannitol Salt Agar,Staphylococcus epidermidis on Columbia CNA Agar,Staphylococcus epidermidis does not normally produce pigment.,3. 生化特性本菌大多數(shù)能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不產(chǎn)生靛基質(zhì)，能還原硝酸鹽，可凝固牛乳，MR

26、試驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)不定。多數(shù)致病性菌株過氧化氫酶和血漿凝固酶陽性，產(chǎn)生金黃色色素，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。,一、金黃色葡萄球菌簡介,致病性和非致病性葡萄球菌的鑒別,4. 血清學(xué)特性葡萄球菌有蛋白質(zhì)抗原和多糖類抗原。蛋白質(zhì)抗原為完全抗原，有種屬特異性，無型別特異性；存在于葡萄球菌表面，是細(xì)胞壁的成分，稱為葡萄球菌A蛋白（Staphylo-coccus protein A，SPA）。 多糖類抗原為半抗原，有型特異性，可用來對葡萄

27、球菌進(jìn)行分型。,一、金黃色葡萄球菌簡介,二）葡萄球菌腸毒素 在生長繁殖過程中產(chǎn)生很多毒素和酶，其中主要有溶血毒素、腸毒素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶、DNA酶、耐熱性核酸酶和透明質(zhì)酸酶等。葡萄球菌腸毒素（enterotoxin）是一種多肽單鏈結(jié)構(gòu)的可溶性蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)的有A、B、C1、C2、C3、D、E、F共8個型，引起中毒的以A型最多。 葡萄球菌腸毒素耐熱，一般烹飪溫度不能將其破壞，經(jīng)100℃煮沸30min不被破壞，

28、100℃ 60min仍保持部分活性。也不受胰蛋白酶的影響。,一、金黃色葡萄球菌,二、案例分析1.中毒事件  梧州市某大酒店200多名員工于2012年6月11日11時左右，在單位食堂集體進(jìn)午餐，其中9名員工進(jìn)食了同事從廣州帶回的鹵鴨食品（封口塑料袋包裝），中午13時30分左右，該9名員工中有5名出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，其中3名癥狀較重的患者到當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就珍；其他未食鹵鴨食品的員工未出現(xiàn)上述癥狀。,2.標(biāo)本采集

29、      采集3名到醫(yī)院就診的患者肛拭子標(biāo)本，置C-B運(yùn)送培養(yǎng)基中保存。        在酒店現(xiàn)場采集患者吃剩的周黑鴨脖、絕味鴨脖、絕味鴨翅共3份可疑食品 3.標(biāo)本處理  病人肛拭子 把病人肛拭子直接劃到選擇性平板分離培養(yǎng)后，用生理鹽水把肛拭子沖洗稀釋，分別接種到各種致病菌

30、增菌培養(yǎng)基中作增菌培養(yǎng)，6-24h后劃選擇性平板作分離培養(yǎng)。,食品樣品則用相應(yīng)致病菌的增菌液225ml，分別取25g樣品作1:10稀釋后進(jìn)行增菌培養(yǎng)，6-24h后劃選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)。 4.可疑菌落挑選 從所有直接和增菌后接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、副溶血弧菌、蠟樣芽胞桿菌等均未見生長。挑取在B-P平板上直徑在2-3mm，灰黑色、邊緣淡色、周圍有一混濁帶、外層有一透明圈的菌落

31、進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并接種至營養(yǎng)瓊脂平板純化后進(jìn)行生化試驗(yàn)。,5.生化鑒定試驗(yàn)  挑取G+球菌的純化菌株，接種至腦心浸液肉湯培養(yǎng)24h后，取0.3ml加入兔血漿中混勻，同時做金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株對照，表皮葡萄球菌陰性菌株對照，置36±1℃溫箱。經(jīng)1h后觀察，樣品菌株和標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株的血漿凝固酶均呈現(xiàn)凝固，陰性菌株的血漿凝固酶在6 h內(nèi)都不出現(xiàn)凝固。 另取樣品菌株、陽性菌株和陰性菌株

32、的肉湯菌液分別在2份甘露醇生化管中各滴加3d，分別作需氧和厭氧培養(yǎng)24h，結(jié)果樣品菌株、陽性菌株均發(fā)酵甘露醇，陰性菌株不發(fā)酵甘露醇。,6.腸毒素檢測 對檢出的金黃色葡萄球菌菌株送區(qū)CDC檢測，腸毒素試驗(yàn)均為陽性，其毒素型均為B型。 7.結(jié)論 3份患者的肛拭子標(biāo)本均檢出金黃色葡萄球菌，未檢出其它致病菌。     3份可疑鹵鴨食品中，絕味鴨脖檢出金黃

33、色葡萄球菌，未檢出其它致病菌。其余2份可疑鹵鴨食品未檢出致病菌。     根據(jù)本次病患者的臨床表現(xiàn)、潛伏期、流行病學(xué)特點(diǎn)，以及實(shí)驗(yàn)室病原菌分離及鑒定結(jié)果，確認(rèn)這是一起由金黃色葡萄球菌污染“絕味鴨脖”引起的食物中毒事件 。,一）常規(guī)檢驗(yàn)（GB/T 4789.10-2003）,二、葡萄球菌檢驗(yàn),,取檢樣進(jìn)行增菌和分離培養(yǎng)，觀察溶血情況，然后挑取可疑菌落做涂片鏡檢，并進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。凡

34、形態(tài)和菌落特征典型，溶血，血漿凝固酶陽性，即可報告為金黃色葡萄球菌。,二）葡萄球菌致病因子測定 血漿凝固酶試驗(yàn)、耐熱核酸酶試驗(yàn)、酸性磷酸酶試驗(yàn)、鉬酸銨還原試驗(yàn)和腸毒素檢測等 。1、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)（血漿凝固酶有助于細(xì)菌抵抗宿主體內(nèi)的吞噬細(xì)胞和殺菌物質(zhì)的作用，同時也是感染局限化。 ） 致病性菌株一般為血漿凝固酶陽性(Coagulase positive )。 檢驗(yàn)方法有玻片法、試管法和微管法,二、葡萄球

35、菌檢驗(yàn),二）葡萄球菌致病因子測定 1、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)2、耐熱核酸酶試驗(yàn) 近年來發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的核酸酶能耐受煮沸而不被破壞，且其最適pH為9.0，這些特點(diǎn)與其它細(xì)菌不同，可作為鑒定方法之一。 （在感染部位的組織細(xì)胞和白細(xì)胞崩潰時可釋放核酸使?jié)B出液粘性增加，核酸酶能迅速分解核酸，利于細(xì)菌的擴(kuò)散 ）3M快速金黃色葡萄球菌數(shù)測試片：金黃色葡萄球菌呈紅色或藍(lán)色菌落，耐熱核酸酶環(huán)帶顯示粉紅色。,二、葡萄球菌檢驗(yàn),二）葡萄球菌

36、致病因子測定 1.血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)2.耐熱核酸酶試驗(yàn)3.毒素測定 從食品檢樣中提取和檢測腸毒素采用濃縮法層析法和ELISA法。,二、葡萄球菌檢驗(yàn),,致病性（致瀉性）大腸埃希氏菌及其檢驗(yàn)Examination of diarrheogenic Escherichia coli,德國毒黃瓜事件2011年5月中旬，食用毒黃瓜引起的疫病在德國開始出現(xiàn)。2011年5月30日，德國因食用有毒黃瓜，感染出血性大腸桿菌而死亡的人數(shù)

37、已升至14人，目前疫情仍在蔓延。此外，包括瑞典、丹麥、英國和荷蘭在內(nèi)的多個國家均已出現(xiàn)感染病例，歐洲一時陷入恐慌……,6月中旬已經(jīng)造成至少16人喪生和1000多人生病住院，其中400多人病勢嚴(yán)重，存在生命危險。,隨后，德國指責(zé)西班牙黃瓜為罪魁禍?zhǔn)?，西班牙黃瓜滯銷。,西班牙得以澄清 德國有關(guān)實(shí)驗(yàn)室對此前已被查出帶有EHEC菌的兩根西班牙黃瓜進(jìn)行了進(jìn)一步化驗(yàn)，結(jié)果顯示，黃瓜上攜帶的菌株特性與從德國兩名患者糞便樣本中分離出的血

38、清型為O104的大腸桿菌并不相符。由此推斷，西班牙進(jìn)口黃瓜上雖然攜帶EHEC菌，但它并不是引起德國本次疫情的致病原。 西班牙蔬果種植業(yè)損失可能將達(dá)２億歐元。,引發(fā)此次“毒黃瓜”事件的罪魁禍?zhǔn)渍俏宕笾虏⌒源竽c桿菌中的EHEC，這種大腸桿菌不僅具有劇毒而且還能抵制多種抗生素?！　≡诘聡鴿h堡接受治療的感染者中有30%的人患上了溶血性尿毒癥綜合征，該疾病足以導(dǎo)致危及性命的腎臟衰竭。罪魁禍?zhǔn)祝貉棵绮耸沁@次疫情傳染源頭。這家

39、農(nóng)場已經(jīng)完全查封。有關(guān)機(jī)構(gòu)表示，正在檢查其他生產(chǎn)芽苗菜的農(nóng)場。但迄今，調(diào)查人員還沒有從任何食物樣本中找到病原體——腸出血性大腸桿菌O104：H4。,大腸桿菌及其檢驗(yàn),條件性致病菌（opportunistic pathogen） 致病性大腸埃希氏菌 是指能使人、動物(esp.嬰兒和幼齡動物)感染及人食物中毒的一群大腸桿菌。致病性大腸埃希氏菌屬主要分為五大類 1、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)

40、 2、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC) 3、腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC) 4、腸道出血性大腸埃希氏菌(EHEC) O157:H7 5、腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC),致病大腸埃希菌種類,大腸桿菌簡介,1．形態(tài)與染色特性菌體兩端鈍圓，中等大小，桿狀(有時呈卵圓形)；1~3µm X 0.6µm；周生鞭毛，能運(yùn)動；不產(chǎn)生莢膜，無芽孢；

41、革蘭氏陰性。有時兩端著色較濃，要與巴氏桿菌區(qū)分開來。,大腸桿菌簡介,1．形態(tài)與染色特性2．培養(yǎng)特性1)需氧及兼性厭氧菌2)對營養(yǎng)要求不高3)在普通瓊脂平板長成中等大小的菌落。與沙門氏菌菌落較相似。4)在普通肉湯中18～24h均勻渾濁，而后底部出現(xiàn)粘性沉淀物，并伴有臭味。能形成菌膜。,大腸桿菌簡介,1．形態(tài)與染色特性2．培養(yǎng)特性5）部分菌落可出現(xiàn)β溶血。6）遠(yuǎn)藤瓊脂：帶金屬光澤的紅色菌落7）S．S瓊脂：多不生長，少數(shù)

42、生長的細(xì)菌，也因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而形成紅色菌落8）伊紅美蘭（EMB）瓊脂：紫黑色菌落，有的有金屬光澤9）麥康凱瓊脂：菌落呈紅色,一、生物學(xué)特性1．形態(tài)與染色特性2．培養(yǎng)特性3．生化特性1）可發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不典型菌株不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖；2）大多數(shù)菌株對賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸有脫羧基作用。3）不產(chǎn)生H2S，不液化明膠，不分解尿素4）不能在氰化鉀培養(yǎng)基上生長，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)陰性，不利用枸櫞酸鹽。此為典

43、型的大腸埃希氏菌特性。,IMViC試驗(yàn)： I：吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)， M：甲基紅試驗(yàn)， Vi：V-P試驗(yàn)， C：枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)典型大腸桿菌IMViC試驗(yàn)為+、+、-、-。如IMViC試驗(yàn)為+、+、-、-，且乳糖發(fā)酵，表明被檢物已有糞便污染，有發(fā)生腸道傳染

44、病的危險，這是衛(wèi)生細(xì)菌中常用的檢測指標(biāo)。,,一、生物學(xué)特性1．形態(tài)與染色特性2．培養(yǎng)特性3．生化特性4.血清學(xué)特性 大腸埃希氏菌的抗原構(gòu)造主要由菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和莢膜抗原(K)三部分組成。1）O抗原本菌已發(fā)現(xiàn)有170種O抗原，分別以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。2）H抗原一種大腸埃希氏菌只有一種H抗原，無鞭毛則無H抗原。H抗原共有64種。,4.血清學(xué)特性 3）K抗原 又稱

45、包膜抗原。共有103種。新分離的大腸埃希氏菌70％具有K抗原。根據(jù)耐熱性可把K抗原分為A、B、L三類，B抗原與L抗原不耐熱，A抗原耐熱性強(qiáng)。如：根據(jù)大腸埃希氏菌抗原的鑒定結(jié)果，寫出其抗原式，如O111：K58(B)H12。,一、生物學(xué)特性1．形態(tài)與染色特性2．培養(yǎng)特性3．生化特性4. 血清學(xué)特性 5．抵抗力 6．毒素特性 有些大腸埃希氏菌產(chǎn)生腸毒素。1）不耐熱腸毒素（heat-labile enterot

46、oxin，LT）：60℃ 30分破壞?？梢鹉c道分泌增加，出現(xiàn)腹瀉。2）耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：100℃ 30分鐘仍有活性?？梢鹉c分泌增加。,中毒典型事例,事例1 日本 1996年7月 大腸桿菌O157: H7型食物中毒9017人中毒，10人死亡原因與生食蘿卜苗有關(guān)。事例2 中國江蘇、安徽等地 2001年大腸桿菌O157: H7食物中毒1

47、77人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。,三、檢驗(yàn)檢驗(yàn)方法 包括增菌、細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)、大腸桿菌致病性鑒定（血清學(xué)試驗(yàn)、毒素檢測等）。致病性大腸桿菌的檢驗(yàn)程序 見GB/T 4789.6-2003),,三、檢驗(yàn) 1. 增菌 2. 細(xì)菌分離 3. 生化試驗(yàn) 4. 血清學(xué)試驗(yàn) 5. 毒素檢測 6. 結(jié)果判定與報告,,增菌培養(yǎng)1、以無菌操作稱取樣品25g，加入225mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，可用滅菌砂在研缽中

48、磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品。2、取適量接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，測定大腸菌群MPN；其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培養(yǎng)6h。挑取一環(huán)，接種于一管腸道菌增菌肉湯中，42℃增菌培養(yǎng)18h。,,分離培養(yǎng)1、將發(fā)酵乳糖陽性管液和增菌液分別劃線接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。2、于36±1℃培養(yǎng)18~24h觀察菌落對于污染嚴(yán)重的食品可直接按劃線法接種，不經(jīng)過增菌過程。,,生化試驗(yàn)在鑒別平板上挑取菌落5個以上，

49、分別接種于TSI瓊脂，以及pH7.2尿素、蛋白胨水、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中。經(jīng)36 ℃ 培養(yǎng)18～24h。TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性、KCN陰性和尿素酶陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌。 TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN和尿素酶任何一項(xiàng)陽性的為非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。,,血清學(xué)試驗(yàn)假定試驗(yàn)：從平板上挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸埃希氏菌的培養(yǎng)物，用EPEC、EIEC、ETEC三種多價O血

50、清和EHEC　O157診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)。當(dāng)與某一多價O血清凝集時，再用該多價血清包括的單價O血清分別做試驗(yàn)，出現(xiàn)凝集即為假定試驗(yàn)陽性。證實(shí)試驗(yàn)：單管凝集試驗(yàn) （Ｏ抗原＋１﹕４０Ｏ血清）,,腸毒素試驗(yàn)ＥＬＩＳＡ檢測ＬＴ和ＳＴ：①LT檢測方法（雙抗體夾心法） ②ST檢測方法（抗原競爭法） 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測ＬＴ：乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測ＳＴ,,蠟樣芽胞桿菌及其檢驗(yàn)Examination of Bacillus cereus

51、,蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）食物中毒于1950年由Hauge首次報道于挪威，此后歐美許多國家都有陸續(xù)報道。本菌引起的食物中毒在我國亦屢有發(fā)生。作為一種常見的腐敗細(xì)菌，該細(xì)菌廣泛分布于自然界中，極易污染食品。引起中毒的原因食品范圍很廣，包括肉類、乳類制品、蔬菜、湯汁、豆芽、點(diǎn)心、剩飯等，尤其多見于熟食品。 蠟樣芽孢桿菌食物中毒的機(jī)制比較復(fù)雜，一般認(rèn)為是由活菌及其產(chǎn)生的腸毒素共同作用所致。,蠟樣芽胞桿菌可產(chǎn)生嘔吐型和

52、腹瀉型兩種。 兩型均不發(fā)熱，預(yù)后良好。 該細(xì)菌為條件致病菌，當(dāng)食品中細(xì)菌含量達(dá)到106個/g時，人食入后可導(dǎo)致食物中毒發(fā)生。,一、生物學(xué)特性,蠟樣芽孢桿菌的形態(tài)、染色、生化及培養(yǎng)特性與普通培養(yǎng)下的炭疽桿菌極為相似，故又稱之為“類炭疽”。1.形態(tài)染色特性本菌為革蘭氏陽性大桿菌，菌體兩端較平整，短鏈或長鏈狀排列。無莢膜，芽孢呈橢圓形，位于菌體中央或稍偏于一端。有鞭毛，可運(yùn)動。,Variations in endo

53、spore morphology. (1, 4) Central endospore (2, 3, 5) terminal endospore(6) lateral endospore,一、蠟樣芽孢桿菌,2. 培養(yǎng)特性需氧菌對營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落為灰白色、表面粗糙，類似蠟滴狀。在血液瓊脂上，可形成淺灰色、不透明、扁平、邊緣不整齊的毛玻璃樣菌落，有β-溶血。在甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂上，本菌菌落為粉

54、紅色，菌落周圍環(huán)繞白色輪暈。,B. cereus on sheep blood agar plate,,普通瓊脂上菌落,MYP上的蠟樣芽胞桿菌,一、蠟樣芽孢桿菌,3. 生化特性分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、水楊苷和覃糖，不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、肌醇、山梨醇和側(cè)金盞花醇；靛基質(zhì)陽性；MR試驗(yàn)陰性，V-P試驗(yàn)陽性；不分解尿素；KCN試驗(yàn)陽性；卵磷脂酶陽性；能利用枸櫞酸鹽；能還原硝酸鹽；過氧化氫酶陽性；可液化明膠。,過氧化

55、氫酶（觸酶）試驗(yàn),二、檢驗(yàn),常規(guī)檢驗(yàn)法： GB/T 4789.14-2003 1、菌數(shù)測定 2、證實(shí)試驗(yàn)3、動物試驗(yàn) 4、血清學(xué)試驗(yàn),1．菌數(shù)測定 無菌采取檢樣25g（mL），用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液作10–1~10–5的稀釋液，每稀釋度各取0.1mL均勻涂布于選擇培養(yǎng)基（MYP瓊脂），37℃培養(yǎng)12~20h，選擇典型菌落數(shù)在30個左右者進(jìn)行計數(shù)，蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，周圍有粉紅色的輪暈。計數(shù)后，從中挑出

56、5個典型菌落作證實(shí)試驗(yàn)。根據(jù)證實(shí)為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計算出該平皿內(nèi)的本菌數(shù)，然后乘以其稀釋倍數(shù)，即得到每g（mL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量。例如，MYP平板上可疑菌落為25個，取5個鑒定，證實(shí)為4個，該平板樣品稀釋倍數(shù)為104，則1g（mL）檢樣中蠟樣芽孢桿菌數(shù)為： 25×4/5×104×10=2×106,檢 樣,作成10–1~10–5的稀釋液,選擇性培養(yǎng)基 (菌

57、數(shù)測定) MYP,選擇性培養(yǎng)基(細(xì)菌培養(yǎng))MYP,菌落計數(shù),肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,報 告,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,36±1℃ 12~20h 36±1℃ 12~20h,生長及菌 染色鏡檢 生化試驗(yàn) 菌株保存落觀察,蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)程序,2．動物試驗(yàn) 將蠟樣芽孢桿菌的24h肉湯培養(yǎng)物0.3~0.5mL接種

58、于體重18~20g 的小白鼠腹腔內(nèi)。動物于24h內(nèi)（通常12~18h后）死亡?？蓮乃劳鲂∈蟮男呐K血液中分離到此菌。也可利用動物做毒素試驗(yàn)，如用家兔腸管結(jié)扎法進(jìn)行腸毒素試驗(yàn)，對猴子或貓采用灌胃法進(jìn)行嘔吐試驗(yàn)，及小白鼠尾靜脈注射檢測腸毒素等。3. 血清學(xué)試驗(yàn) 常用凝集試驗(yàn)檢查該菌。也可用反向間接血凝試驗(yàn)或瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)來檢測腸毒素。,有毒有害物質(zhì)篩選實(shí)驗(yàn),1.許來爾氏三管法 此法可預(yù)試氰化物、磷化物、硫化物及重金屬元素，是目前

59、常用的一種方法。,氰化物,磷化物,硫化物,,,,苦味酸鈉試紙條,硝酸銀試紙條,乙酸鉛試紙條,變紅,變黑,變黑,如上述三種試紙條均不變色，說明檢材中不含氰化物、磷化物和硫化物。樣品中加入洗好的銅片（或銅絲）2～3片（個），在沸水浴上加熱45min，如果銅片（銅絲）變色，示有重金屬毒物存在。如果銅片變灰黑色可能含砷，變黑色可能含鉍，變灰紫色可能含銻，變銀白色可能含汞，需進(jìn)一步做確證實(shí)驗(yàn)。如果銅片（銅絲）不變色說明檢材中不含有重金屬毒物。,

60、2.檢毒管法 檢毒管有5種管（3、5、6、8、10號）可直接用于毒物檢驗(yàn)。,汞的檢測,水俁病事件,1956年發(fā)生于日本的由于工業(yè)廢水排放（含汞）污染造成的公害病。,慢性甲基汞中毒以日本的水俁病最為聞名，1956年日本熊本縣水俁灣地區(qū)發(fā)生甲基汞中毒事件，由于是第一次因環(huán)境污染而引起的，故因地而命名。當(dāng)時中毒死亡41人，以后時有發(fā)病，截止到1979年，發(fā)病人數(shù)1004人，死亡206人。起因是附近的一家化工廠在生產(chǎn)乙醛和氯乙烯的過

61、程中，將作為催化劑的無機(jī)汞排放到海水中，通過在魚體中甲基化后被魚體進(jìn)一步濃縮（魚體中的汞含量達(dá)到20~40mg/Kg）。當(dāng)時發(fā)病與食用魚的關(guān)系是，不吃的不發(fā)病，吃多的早發(fā)病，吃少的遲發(fā)病。,汞(Mercury)是一種對人體有害的元素，汞及其化合物均有一定的毒性，汞在常溫下的揮發(fā)作用和生物濃縮作用，使得汞對環(huán)境的污染尤其被人們重視。汞中毒已被列為世界上最嚴(yán)重的公害之一。,汞的自然來源 地殼氣體的排出 火山噴發(fā) 水自

62、然態(tài)中的蒸發(fā)人類對汞的使用 氯堿工業(yè) 電力工業(yè)（燃煤） PVC（聚氯乙烯） 金礦開采 節(jié)能燈 電池,（一）汞的來源,（二）汞對食品的污染1. 汞在魚體內(nèi)的甲基化 排放到環(huán)境中汞主要是無機(jī)汞，其次還有有機(jī)汞。無機(jī)汞對人體毒性不大，但是，一旦當(dāng)無機(jī)汞進(jìn)入到水體以后，則會通過微生物轉(zhuǎn)化而甲基化，形成甲基汞。,環(huán)境中的無機(jī)汞,,甲基汞,水中微生物作用,甲基化,,食物鏈,,人 體,生物濃縮,在水中由

63、無機(jī)汞經(jīng)厭氧菌作用形成。經(jīng)食物鏈富集后在魚體內(nèi)可形成較高濃度，從而對人體產(chǎn)生有害作用。,甲基化過程不但存在于水底淤泥中的微生物，魚體表面的微生物也有極強(qiáng)的甲基化作用。 魚體中的汞主要是甲基汞，甲基汞可占魚體中汞含量的80%~100%。甲基汞由于其脂溶性大，隨食品進(jìn)入到人體后排泄很慢，尤其是進(jìn)入到腦中后，則很難排出。有人證明，魚體中的甲基汞用凍干、油炸、煮、干燥等方法均不能除去。,（3）汞對食品的污染（續(xù)） 1. 汞在魚體內(nèi)的甲基

64、化 2.汞的生物濃縮汞的生物濃縮作用在重金屬元素中是最強(qiáng)的。 污染環(huán)境的汞，在土壤中通過陸生食物鏈濃縮；在水體中，可通過水生食物鏈得到加強(qiáng)，而最終進(jìn)入到人體中。其中水生食物鏈的濃縮作用更強(qiáng)。,藻類可將汞濃縮2000~17000倍，某些水生昆蟲可達(dá)11700倍；淡水的浮游植物可將汞濃縮1000倍，淡水的無脊椎動物竟高達(dá)10萬倍。 3. 汞的植物內(nèi)吸作用 植物的根、莖、葉均可吸收環(huán)境中的汞。 植物只可吸收環(huán)境中

65、的汞，不能將汞濃縮。,（四）汞對人體的危害,1.汞及其化合物的毒性各種汞化物都有毒，但毒性的大小差別很大，凡在水和稀酸中溶解度大的，其毒性就大。一般來說有機(jī)汞的毒性大于無機(jī)汞更大于金屬汞 。金屬汞在腸道的吸收率低于0.01%，因此金屬汞基本無毒，但汞蒸氣是一種對人體具有劇毒作用的氣體，它可通過皮膚和呼吸道被人體吸收。無機(jī)汞腸道吸收率不超過15%，硫酸汞毒性最強(qiáng)，硫化汞毒性最??；進(jìn)入人體后主要蓄積在腎臟，其次為肝臟、脾臟。,,,甲

66、基汞毒性：有機(jī)汞：在有機(jī)汞化和物中，甲基汞是毒性最強(qiáng)的。而且在人體內(nèi)吸收率可達(dá)90%以上，進(jìn)入人體后除蓄積于腎臟、肝臟外，還可通過血腦屏障，進(jìn)入腦內(nèi)。甲基汞的生物半衰期較長，在腦中甲基汞半衰期為240天，排出較慢，對人體危害較大。甲基汞還可透過胎盤侵入胎兒體內(nèi)使胎兒發(fā)生中毒；另外，甲基汞對遺傳基因的破壞作用也引起了人們的注意。,3.慢性汞中毒攝入微量汞，可排出，不致危害健康攝入高劑量有機(jī)汞――急性中毒長期微量汞攝入――蓄

67、積中毒,汞中毒臨床三大癥狀 ①神經(jīng)癥狀：易興奮癥， 是汞中毒的特有癥狀， ②肌肉震顫 ③口腔炎,1）神經(jīng)癥狀： “易興奮癥”是汞中毒的特有癥狀，表現(xiàn)為乏力、頭痛、記憶力減退、不安、失眠、易激動、無故煩躁、易怒、愛哭等。 2）肌肉震顫： 最初可感覺全身無力，四肢肌肉痙攣或疼痛等。以后則出現(xiàn)震顫，多自手指開始，向上發(fā)展至腕、頭、上肢或下肢。開始一般為非對稱性、無節(jié)律的細(xì)小震顫，逐漸發(fā)展為粗大的意向性震顫。 3）口

68、腔炎： 口中有金屬味，流有增多，牙齦酸疼、口干?？诖秸衬?、舌部可發(fā)生腫脹及潰瘍。牙齦紅腫、壓疼、刷牙時易出血。有時在齒齦邊緣形成暗藍(lán)色色素沉著，稱為“汞線”。,舉例1----美白化妝品警惕汞中毒,美白是全世界的難題，目前還沒有一種添加劑能讓人既安全又快速達(dá)到美白目的，充其量只能減緩色斑生成過程，或者阻斷黑色素形成的中間體。而汞被稱為“黑色素細(xì)胞的毒藥”，它能殺死黑色素細(xì)胞，讓皮膚變白。因此有些美白增白產(chǎn)品，便添加了“黑色素細(xì)胞的毒藥”

69、，長期使用這種含汞產(chǎn)品會造成人體積累性中毒。,舉例 3“汞都”光環(huán)背后,貴州萬山特區(qū)稱為中國曾經(jīng)的“汞都”，一點(diǎn)都不夸張。早在唐宋時期，這里就以盛產(chǎn)朱砂(一種含汞的礦物)、水銀(汞的俗稱)而聞名。其汞資源儲量約為亞洲第一、世界第二，高峰時年產(chǎn)量更是一度占到全國的七成。30年累計上繳稅利15億元，工業(yè)產(chǎn)值折合現(xiàn)值達(dá)124億元。,萬山汞礦在從輝煌到衰落的短短45年間，共排放含汞廢氣202億立方米，工業(yè)廢渣426萬立方米，廢水5192萬噸

70、。其中廢氣超標(biāo)高達(dá)5449倍，廢水和廢渣也分別超標(biāo)236倍和214.5倍。礦區(qū)空氣中的汞含量為0.0053mg/立方米，超標(biāo)1.67倍;而生活飲用水最高含汞量，則超標(biāo)36倍。小白菜含汞量超標(biāo)將近100倍;主要檢測農(nóng)作物中含汞量最少的玉米，也超標(biāo)10倍。沒有直接參與汞作業(yè)的城鄉(xiāng)居民汞中毒患病率也達(dá)4.18%，各種結(jié)石病的發(fā)病率位居國內(nèi)最高水平，各種癌癥的發(fā)病率也高企不下。 當(dāng)?shù)貛缀?0%的農(nóng)產(chǎn)品全部依賴外省輸入。“不喝本地水，不吃