辛伐他汀對(duì)心衰心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣泵的影響

1、辛伐他汀對(duì)心衰心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣泵的影響,蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院：曲輔政指導(dǎo)教師：劉志華教授,一．研究背景,慢性心力衰竭是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，因致死率、致殘率高，一直是臨床研究重點(diǎn)。當(dāng)今國(guó)內(nèi)外對(duì)慢性心力衰竭病理生理的研究更多集中于興奮收縮的鈣循環(huán)環(huán)節(jié)。鈣循環(huán)過(guò)程主要包括肌漿網(wǎng)（SR）鈣釋放、鈣回?cái)z、鈣儲(chǔ)存三個(gè)過(guò)程。,正常情況下，心肌舒張期SERCA2a（肌漿網(wǎng)鈣泵）將大部分鈣離子回?cái)z到肌漿網(wǎng)儲(chǔ)存， SERCA2a的調(diào)節(jié)包括直接調(diào)節(jié)和間接調(diào)

2、節(jié)。 CaMKⅡ（鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ)發(fā)揮直接調(diào)節(jié)作用，PLB（受磷蛋白）發(fā)揮間接調(diào)節(jié)作用；PLB去磷酸化時(shí)與SERCA2a結(jié)合，抑制了SERCA2a對(duì)鈣離子的親和力，而PLB磷酸化后與SERCA2a解離，SERCA2a對(duì)鈣離子的親和力增加,對(duì)鈣離子的回?cái)z能力提高。PLB有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即絲氨酸-16、蘇氨酸-17、絲氨酸-10位點(diǎn)；但主要發(fā)揮作用的是絲氨酸-16位點(diǎn)。絲氨酸-16位點(diǎn)由PKA(蛋白激酶A)磷酸化、 PP1α（磷

3、酸酶1α）去磷酸化。心衰時(shí)心肌細(xì)胞SERCA2a表達(dá)及活性有無(wú)變化，其變化的機(jī)制是什么?他汀類藥物用于慢性心力衰竭治療，可改善心功能，減輕心力衰竭癥狀。對(duì)肌漿網(wǎng)鈣泵有何影響?目前國(guó)內(nèi)外文章鮮見(jiàn)報(bào)道。,,通過(guò)觀察辛伐他汀對(duì)心衰心肌細(xì)胞PLB、SERCA2a、CaMKⅡ、PKA、PP1α的表達(dá)以及SERCA2a功能、PKA、CaMKⅡ活性的影響，探討心力衰竭的分子生物學(xué)機(jī)制以及辛伐他汀改善心力衰竭的分子生物學(xué)機(jī)制。,二．研究目的,三．研究

4、方法,1 研究對(duì)象：,18只家兔，雌雄不拘，分為3組： 假手術(shù)組6只，心力衰竭組 6只，辛伐他汀干預(yù)組 6只(術(shù)后即予辛伐他汀10mg/kg/d，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。,2.實(shí)驗(yàn)方法：2.1：心衰模型的建立（主動(dòng)脈瓣損傷+腹主動(dòng)脈縮窄法）：①用戊巴比妥麻醉家兔，從右側(cè)頸總動(dòng)脈用4F導(dǎo)管破壞主動(dòng)脈瓣。②2周后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄。用戊巴比妥麻醉，打開(kāi)腹腔，在腎動(dòng)脈上方，將腹主動(dòng)脈縮窄50%左右。③觀察指標(biāo)：包括呼吸、活動(dòng)、進(jìn)食、紫紺情況。,

5、藥物對(duì)左室重構(gòu)的影響 ①心臟超聲觀察心臟變化，觀察指標(biāo)：左房?jī)?nèi)徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)、左室縮短率。 ②解剖學(xué)觀察藥物對(duì)心室重構(gòu)的影響：觀察心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)、左室重量指數(shù)。 ③血液動(dòng)力學(xué)觀察：觀察左室舒張末壓、左室收縮末壓。,2.2 RT-PCR檢測(cè)心肌組織PLB、SERCA2a mRNA表達(dá): ①抽提mRNA ②逆轉(zhuǎn)錄 ③擴(kuò)增

6、 SERCA2a 正義引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG； 反義引物：R-CAGCACCATCAGCCACT； PLB 正義引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA； 反義引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； β-actin 正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT

7、； 反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ；,擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)入PCR循環(huán),94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)35次再延伸7min。SERCA2a、PLB與β-actin擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為464、368、231bp。 ④電泳 ⑤圖像分析,2.3 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞膜SERCA2a、細(xì)胞漿CaMKⅡ、PKA、

8、PP1α蛋白表達(dá):①提取心肌細(xì)胞膜、細(xì)胞漿蛋白；②用BCA法測(cè)定蛋白濃度；③Western blot分別檢測(cè)心肌細(xì)胞膜SERCA2a蛋白、細(xì)胞漿CaM、CaMKⅡ、PKA、PP1α蛋白表達(dá)。,2.4 γ-32P底物摻入法測(cè)定CaMKⅡ、PKA的活性: ①提取細(xì)胞漿蛋白； ②用BCA法測(cè)定蛋白濃度； ③按CaMKⅡ、PKA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定二者的活性。,2.5 無(wú)機(jī)磷酸根法測(cè)定SERCA2a活性: ①制備肌漿網(wǎng)；

9、 ②用BCA法測(cè)定蛋白濃度； ③按試劑盒說(shuō)明測(cè)定SERCA2a的活性。,2.6 利用光譜熒光檢測(cè)技術(shù)測(cè)定肌漿網(wǎng)的攝鈣能力: ①制備肌漿網(wǎng)； ②用BCA法測(cè)定蛋白濃度； ③測(cè)定肌漿網(wǎng)的攝鈣能力。 計(jì)算公式 [Ca2+]=Kd×（Rt﹣Rmin）/（Rmax﹣Rt）×Sf2/Sb2,3 統(tǒng)計(jì)分析 各組測(cè)得數(shù)值均以X±s表示，組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗(yàn) （SAS6.12

10、版本），P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。,4.結(jié) 果,,4.1 3組觀察開(kāi)始時(shí)LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較： 3組家兔手術(shù)前 LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs 、 FS及EF無(wú)明顯差別（p＞0.05）,4.2 3組觀察終止時(shí)LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較： 觀察終止時(shí)心衰組LAd、IVSd、LVPw

11、d、LVIDd、LVIDs較假手術(shù)組明顯增加（P<0.05），而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低（P<0.05）；心衰組FS及EF較假手術(shù)組明顯降低（P<0.05），而他汀組FS及EF較心衰組明顯增加（P<0.05）,4.3 3組血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較： 3組家兔手術(shù)前血流動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯差別；觀察終止時(shí)，心衰組HR、LVESP和LVEDP較假手術(shù)組明顯增加（P<0.05）；而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低

12、（P<0.05）,4.4 3組心臟、左心室、心臟重量指數(shù) 、左室重量指數(shù)比較： 心衰組家兔心臟外觀較假手術(shù)組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數(shù)、左室重量指數(shù)明顯增加（P<0.05）；而他汀組以上參數(shù)明顯低于心衰組（P<0.05）,4.5 三組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)比較：表1-6：三組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)比較,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組

13、比較▲P<0.05。 心衰組的SERCA2a mRNA水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀組的SERCA2a mRNA水平明顯高于心衰組。,家兔7周后SERCA2a mRNA的表達(dá)比較,圖1-1,圖1-2,4.6 三組心肌組織PLB mRNA表達(dá)比較：表1-7：三組心肌組織PLB mRNA表達(dá)比較,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。 心衰組的PLB mRNA水平顯著低于假

14、手術(shù)組，而辛伐他汀組的PLB mRNA水平明顯高于心衰組。,家兔7周后PLB mRNA的水平表達(dá)比較,圖1-3,圖1-4,4.7 三組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)比較：表1-8：三組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)比較,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。 心衰組的SERCA2a蛋白水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀組的SERCA2a蛋白水平明顯高于心衰組。,家兔7周后SERCA2a蛋白

15、的表達(dá)比較,圖1-5,圖1-6,4.8三組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達(dá)比較：表1-9：三組心肌組織CaMKⅡ蛋白表達(dá)比較,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05 ；與心衰組比較▲P<0.05 。 可見(jiàn)心衰組心肌細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。,家兔7周后CaMKⅡ蛋白的表達(dá)比較,圖1-7,圖1-8,4.9 三組心肌組織PKA蛋白表達(dá)比較：表1-10：三組心肌組織PKA蛋白表達(dá)比較,注：

16、與假手術(shù)組比較*P<0.05 ；與心衰組比較▲P<0.05 。 可見(jiàn)心衰組心肌細(xì)胞PKA表達(dá)顯著低于假手術(shù)組，辛伐他汀組顯著高于心衰組。,家兔7周后PKA蛋白的表達(dá)比較,圖1-9,圖1-10,4.10 三組心肌組織PP1α蛋白表達(dá)比較：表1-11：三組心肌組織PP1α蛋白表達(dá)比較,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05 ；與心衰組比較▲P<0.05 。 可見(jiàn)心衰組心肌細(xì)胞PP1α表達(dá)顯著高于假手

17、術(shù)組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。,家兔7周后PP1α蛋白的表達(dá)比較,圖1-11,圖1-12,4.11 三組心肌組織CaMKⅡ活性比較：表1-12：三組心肌組織CaMKⅡ活性比較,可見(jiàn)心衰組CaMKⅡ活性明顯高于假手術(shù)組，辛伐他汀組CaMKⅡ活性顯著低于心衰組。,圖1-13,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。,4.12 三組心肌組織PKA活性比較：表1-13：三組心肌組織PKA活性比較,可見(jiàn)心衰

18、組PKA活性明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組PKA活性顯著高于心衰組。,圖1-14,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。,4.13 肌漿網(wǎng)囊泡的電鏡圖像：圖1－15,4.14 三組心肌組織SERCA2a活性比較：表1-14：三組心肌組織SERCA2a活性比較,可見(jiàn)心衰組SERCA2a活性明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組SERCA2a活性顯著高于心衰組。,,圖1-16,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05

19、；與心衰組比較▲P<0.05。,4.15 三組心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝鈣能力比較：表1-15：三組心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝鈣能力比較,可見(jiàn)心衰組肌漿網(wǎng)攝鈣能力明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組肌漿網(wǎng)攝鈣能力顯著高于心衰組。,圖1-17,注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與心衰組比較▲P<0.05。,圖1-18家兔心肌肌漿網(wǎng)外反應(yīng)液R值變化曲線,假手術(shù)組,辛伐他汀組,心衰組,5．討 論 大多數(shù)研究表明SERCA2a在心衰時(shí)基因

20、和蛋白表達(dá)下降、活性降低；PLB表達(dá)減少。心衰時(shí)交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興奮，高濃度兒茶酚胺長(zhǎng)期慢性刺激引起心肌β-腎上腺能受體密度下調(diào),cAMP水平降低，PKA活性下降，也有研究表明心衰時(shí)PKA的表達(dá)下降。另外，心衰時(shí)β-腎上腺能受體密度下調(diào)可以引起PP1抑制劑活性降低從而導(dǎo)致PP1α的表達(dá)和活性的增高。PKA表達(dá)減小、活性降低，PP1α表達(dá)增加、活性提高，引起PLB絲氨酸-16位點(diǎn)的磷酸化程度下降，對(duì)SERCA2a的抑制加強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致

21、SERCA2a活性降低，回?cái)z鈣離子的能力下降，細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在SERCA2a活性降低的情況下，NCX(鈉鈣交換體)起到代償作用，NCX將細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞增多， 肌漿網(wǎng)回?cái)z和儲(chǔ)存鈣減少，影響心肌的收縮功能。,心衰時(shí)PLB對(duì)SERCA2a間接調(diào)節(jié)作用下降的同時(shí)，CaMKⅡ的直接調(diào)節(jié)作用增加。其表現(xiàn)為CaMKⅡ表達(dá)和活性增加。但是CaMKⅡ的過(guò)表達(dá)又可引起心肌肥厚，進(jìn)一步加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)。

22、 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心衰組SERCA2a、PLB mRNA水平顯著下降，SERCA2a、PKA蛋白表達(dá)和活性降低，CaMKⅡ和PP1α蛋白表達(dá)增加，CaMKⅡ活性增加，肌漿網(wǎng)的攝鈣能力降低。肌漿網(wǎng)的攝鈣能力降低的原因一方面是因?yàn)镾ERCA2a蛋白表達(dá)下降；另一方面是因?yàn)镻KA蛋白表達(dá)和活性下降以及PP1α蛋白表達(dá)增加可以引起PLB的去磷酸化程度增加，進(jìn)一步引起SERCA2a活性下降。所以SERCA2a活性（下降了44.5﹪）和肌漿網(wǎng)的攝鈣能

23、力（下降了43.1﹪）降低的程度較SERCA2a蛋白表達(dá)（下降了32.4﹪）下降的程度大，并不是與SERCA2a蛋白表達(dá)下降的程度平行。,研究表明血管緊張素Ⅱ可以引起心衰大鼠的SERCA2a表達(dá)和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的SERCA2a表達(dá)和功能，群多普利可以提高心衰大鼠的PLB水平，奧美沙坦能增加心衰大鼠的SERCA2a、PLB和絲氨酸-16位點(diǎn)磷酸化的PLB的表達(dá)，都提示心衰時(shí)RAS系統(tǒng)參與引起了SERCA2a表達(dá)和功能的降

24、低。 研究表明洛伐他汀可以抑制心肌PP1的表達(dá)，提示洛伐他汀的作用可以相當(dāng)于心肌PP1的抑制劑，抑制心肌PP1的表達(dá)和活性。研究證實(shí)阿托伐他汀可以增加肥厚心肌的SERCA2a表達(dá)。另外，研究表明辛伐他汀可以增加正常心肌和培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的SERCA2a表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明辛伐他汀組家兔SERCA2a、PLB mRNA水平增加，SERCA2a、PKA蛋白表達(dá)和活性增加，CaMKⅡ和PP1α蛋白表達(dá)減少，CaMKⅡ活性降

25、低，肌漿網(wǎng)攝鈣能力提高。,辛伐他汀長(zhǎng)期干預(yù)心衰，改善心臟舒縮功能的機(jī)制可能與其提高心衰肌漿網(wǎng)鈣泵的功能有關(guān)。具體機(jī)制可能包括以下因素：（1）抑制了交感神經(jīng)的過(guò)度激活，增加了心肌β-腎上腺能受體密度，提高了PKA的活性，抑制了PP1α的表達(dá)和活性；（2）抑制RAS系統(tǒng)，增加了SERCA2a和PLB的表達(dá)；（3）抑制了CaMKⅡ的表達(dá)和活性；（4）也可能是通過(guò)目前尚不清楚的信號(hào)途徑增加了心衰時(shí)SERCA2a和PLB的表達(dá)，抑制PP1