辛伐他汀對大鼠心肌細胞鈉氫交換體作用研究.pdf

1、第一部分辛伐他汀對大鼠心肌細胞鈉氫交換體作用研究研究
　　 目的：
　　 辛伐他汀 (simvastatin，SIM) 不僅對慢性心血管疾病的防治有明顯的效果，還能夠顯著減輕缺血再灌注導(dǎo)致的糖尿病小鼠心臟損傷。心肌鈉氫交換體 (Na+/H+exchanger，NHE) 是決定心肌缺血再灌注損傷程度的重要因素。早期的文獻資料表明辛伐他汀能夠降低癌細胞內(nèi) pH值，我們最近的研究結(jié)果也表明辛伐他汀能夠快速抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌

2、細胞內(nèi) pH和 Ca2+濃度的升高，辛伐他汀預(yù)處理能夠阻止過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞內(nèi) pH和 Ca2+濃度的升高，從而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細胞調(diào)亡，具體機制不明確。我們的研究設(shè)想是辛伐他汀通過抑制心肌細胞鈉氫交換體而實現(xiàn)其對心肌急性損傷的保護作用，本研究將闡明辛伐他汀新的作用機制，以確立他汀類藥物在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚和心力衰竭防治策略中的地位。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞進行實驗

3、。細胞內(nèi)酸化誘導(dǎo)的：用25mM氯化銨（NH4Cl）處理無碳酸氫鹽的克氏液孵育的心肌細胞3分鐘，緊接著用無Na+的克氏液將NH4Cl沖洗干凈并孵育3分鐘，此時細胞內(nèi)的NH3快速擴散到細胞外，促使NH4+轉(zhuǎn)化為NH3而導(dǎo)致細胞內(nèi)H+增加，細胞內(nèi)酸化，然后再用含Na+的克氏液替代無Na+的克氏液，此時由于補充了Na+，細胞內(nèi)酸化可以激活NHE而使細胞內(nèi)pH得以恢復(fù)；應(yīng)用全波長多功能酶標(biāo)儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞內(nèi)pH；鈉氫交換體的活性用酸化后從無

4、鈉到有鈉階段每分鐘pH的變化率 (dpHi/dt)表示；有研究發(fā)現(xiàn)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular regulated protein kinase，ERK)的激活能減少缺血再灌注損傷誘發(fā)的細胞凋亡，用Western blot檢測心肌細胞 ERK的磷酸化(phosphorylated ERK，p-ERK) 水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.用NHE的抑制劑5-(N-乙基-N-異丙基) 阿米洛利 (5-(N-

5、Ethyl-N-isopropyl) amiloride，EIPA) 5μM，10 μM 作用于無鈉和復(fù)鈉階段，與酸化模型組相比，可以使心肌細胞NHE的活性受抑制達102.9％和109.7％ (P>0.05)，辛伐他汀不同濃度組 (10 nM，100 nM，1000 nM) 抑制NHE的作用不明顯,與模型組比較，分別使心肌細胞NHE的活性降低-0.54％，0.16％，0.58％ (P>0.05)，預(yù)孵育辛伐他汀 (1000 nM) 10

6、 min，20 min，30 min處理對 NHE的抑制作用也不明顯，與模型組比較，分別使心肌細胞NHE的活性降低0.28％，0.39％，0.31％ (P>0.05)。
　　 2.用25mM氯化銨誘導(dǎo)細胞內(nèi)酸化模型，在無鈉階段即開始給藥，加入 EIPA (5μM)、辛伐他汀 (100 nM) 各作用于心肌細胞3 min，提取心肌細胞總蛋白，檢測ERK蛋白磷酸化水平的變化。以總的ERK為參照物，與正常對照組比較，無鈉加辛伐他汀組，

7、有鈉加辛伐他汀組以及有鈉加EIPA組分別可以使心肌細胞ERK的磷酸化水平升高186.9％，137.2％，191.3％ (p<0.05)；與有鈉加辛伐他汀組比較，無鈉加辛伐他汀組又高29.3％ (p<0.05)。
　　 3.用25mM氯化銨誘導(dǎo)細胞內(nèi)酸化模型，在無鈉和復(fù)鈉階段均加入EIPA (5μM) 各作用于心肌細胞3 min，提取心肌細胞總蛋白，并檢測酸化模型每一個環(huán)節(jié)中ERK蛋白的磷酸化水平變化。以總的ERK為參照物，與正常

8、對照組比較，無鈉、有鈉和EIPA組分別可以使心肌細胞 ERK的磷酸化水平升高171.4％，118.2％，174.7％ (p<0.05)；與復(fù)鈉組比較，無鈉組又高24.4％ (p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．辛伐他汀對心肌細胞鈉氫交換體的抑制作用不明顯；
　　 2．細胞內(nèi)酸化刺激心肌細胞，導(dǎo)致ERK的磷酸化水平升高，其中無鈉克氏液階段比復(fù)鈉克氏液階段升高明顯，由此可見，細胞外鈉離子濃度可能與心肌細胞中ER

9、K的調(diào)控有關(guān)。
　　 第二部分細胞外鈉離子濃度對細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的影響
　　 研究目的：
　　 由第一部分研究結(jié)果得知，細胞外無鈉克氏液和有鈉克氏液對心肌細胞中 ERK的磷酸化水平有差異，所以我們設(shè)想細胞外鈉離子濃度與 ERK之間有某種聯(lián)系，我們接下來研究細胞外鈉離子濃度對 ERK的影響。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生 SD 大鼠心肌細胞，應(yīng)用全波長多功能酶標(biāo)儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞

10、內(nèi) pH值；鈉氫交換體的活性用細胞酸化之后每分鐘pH值的變化率(dpHi/dt)表示；用 Western blot 檢測心肌細胞 ERK的磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.使用不同鈉離子濃度 (135mM，100 mM，50 mM，25mM，0 mM)直接孵育心肌細胞10min，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與正常對照組相比，分別使ERK的磷酸化水平升高1.84％，6.65％，8.19％，5.56％，8

11、.86％ (p>0.05)。
　　 2.使用不同鈉離子濃度 (135mM，100 mM，50 mM，25mM，0 mM) 恢復(fù)酸化之后的細胞，并作用3min，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與135mM比較，100 mM組，50 mM組，25mM組，0 mM組分別使 ERK的磷酸化水平升高13.84％，18.6％，17.27％ (p>0.05)和42.27％ (p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 細

12、胞外鈉離子濃度對ERK的影響不明顯，但在細胞內(nèi)酸化后細胞外鈉離子濃度則明顯影響 ERK的磷酸化水平。
　　 第三部分細胞內(nèi)pH值對細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的影響
　　 研究目的：
　　 由第二部分研究結(jié)果得知，雖然在細胞內(nèi)pH正常時細胞外鈉離子濃度的變化對ERK的磷酸化水平無明顯的影響，但細胞內(nèi)酸化后，不同的細胞外鈉離子濃度則對ERK磷酸化水平的表達有顯著的影響，在對細胞內(nèi)酸化后檢測pH值時發(fā)現(xiàn)在無鈉時細胞內(nèi)pH接近6

13、.67 ,而一旦給與短時間的少量鈉離子 (25mM)，細胞內(nèi)pH就可以恢復(fù)到 7.03，所以我們設(shè)想細胞內(nèi)酸化后不同細胞外鈉離子濃度對ERK的影響是由于細胞內(nèi)pH 變化所導(dǎo)致的，我們接下來研究細胞內(nèi)pH值對ERK的影響。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生 SD 大鼠心肌細胞，應(yīng)用全波長多功能酶標(biāo)儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞內(nèi) pH值；用 Western blot 檢測心肌細胞 ERK的磷酸化水平。
　　 結(jié)果

14、：
　　 1.用不同pH值 (7.2，7.0，6.8，6.6)的高鉀溶液孵育心肌細胞8 min后，并測得此時細胞內(nèi)外pH值可以達到一致，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與pH值7.2組比較，pH 7.0，6.8，6.6分別使 ERK的磷酸化水平升高5.22％，7.65％ (p>0.05)和33.96％ (p<0.05)。
　　 2.用ERK的抑制劑 U0126 (3 μM) 作用于細胞酸化過程后，提取心肌細

15、胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與酸化模型組比較，可以使 ERK的磷酸化水平降低66.48％ (p<0.05)。
　　 3.在克氏液孵育的終末階段，用ERK的選擇性抑制劑 U0126 (3 μM) 預(yù)孵育5min并作用于細胞酸化模型的整個過程，與模型組比較，U0126組可以使NHE的活性降低49.46％ (p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 在我們研究的心肌細胞 pHi 范圍 (6.6～7.2) 內(nèi)，p-ER