海棲熱袍菌葡聚糖內(nèi)切酶的克隆表達(dá)及酶學(xué)活性研究.pdf

1、光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，纖維素酶是一類能夠降解纖維素的糖苷水解酶，在生物質(zhì)降解與轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。同時(shí)，纖維素酶在紡織品加工、紙漿脫墨、飼料和洗滌劑工業(yè)具有廣泛的用途。目前市場(chǎng)上的纖維素酶生產(chǎn)成本高、降解效率偏低，難以在工業(yè)上進(jìn)行大規(guī)模的應(yīng)用。提高降解效率和降低酶的應(yīng)用成本的最有效策略是開(kāi)發(fā)應(yīng)用嗜熱微生物產(chǎn)生的高溫酶，實(shí)現(xiàn)催化活性的提高和使用壽命的延續(xù)。海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）是

2、一株極端嗜熱的厭氧細(xì)菌，最適生長(zhǎng)溫度達(dá)到80℃，表現(xiàn)出極強(qiáng)的纖維素水解能力；對(duì)其基因組研究發(fā)現(xiàn)，它的基因組中與糖、多糖代謝有關(guān)的編碼基因占7％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他已經(jīng)測(cè)序的真細(xì)菌和古菌，其基因組中存在大量的多聚糖水解酶的編碼序列。本研究，運(yùn)用基因工程技術(shù)研究海棲熱袍菌葡聚糖內(nèi)切酶（endoglucanase，EG，簡(jiǎn)稱纖維素酶）的高效表達(dá)技術(shù)，鑒定它們的酶學(xué)性質(zhì)及相互協(xié)同作用。主要研究?jī)?nèi)容與研究結(jié)果如下：
　?。?）運(yùn)用基因工程技術(shù)研究

3、纖維素酶在大腸桿菌中的超量表達(dá)技術(shù)。以海棲熱袍菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增8個(gè)編碼不同纖維素酶的基因的成熟肽序列；將PCR產(chǎn)物與大腸桿菌新型熱激表達(dá)載體pHsh連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHsh-EGs。通過(guò)反向PCR技術(shù)克隆得到載體片段，在N端起始密碼子后修改或插入密碼子以提高表達(dá)水平。來(lái)自同1個(gè)菌株的8個(gè)被標(biāo)注為纖維素酶的基因得到成功克隆，并在pHsh載體中得到了有效表達(dá)。
　?。?）對(duì)重組纖維素酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)鑒定。超聲破碎細(xì)

4、胞后獲取粗酶液；通過(guò)熱處理和鎳親和層析兩步法使8種重組酶達(dá)到電泳純。對(duì)8種酶的活性進(jìn)行的初步鑒定表明，Tma-EG12A、Tma-EG12B、Tma-EG5A和Tma-EG74表現(xiàn)出超強(qiáng)的纖維素水解能力；而Tma-EG5B、Tma-EGA、Tma-EGB和Tma-EGC只有微弱的CMC活性。本論文對(duì)Tma-EG12A、Tma-EG12B、Tma-EG5A和Tma-EG74進(jìn)一步進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的鑒定，它們的最適反應(yīng)溫度依次為95℃、90℃

5、、85℃和85℃，最適反應(yīng)pH分別為5.6、5.6、5.2和5.2，四個(gè)纖維素內(nèi)切酶有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，比酶活分別為55.5、213.5、31和4.5U/mg。
　?。?）一種新型甘露聚糖酶的發(fā)現(xiàn)和定性。Tma-EG5B在海棲熱袍菌基因組中被標(biāo)注為纖維素酶（β-1,4-葡聚糖酶），國(guó)外的研究報(bào)道認(rèn)為它是地衣多糖酶（β-1,3-1,4-葡聚糖酶）。本論文研究發(fā)現(xiàn)它以甘露聚糖（β-1,4-甘露聚糖）為底物時(shí)，比酶活高達(dá)112