微生物代謝的人工控制

1、微生物代謝的人工調(diào)控,,第一節(jié) 微生物代謝的人工控制簡介第二節(jié) 發(fā)酵工程流程第三節(jié)微生物代謝的人工調(diào)控方法第四節(jié)微生物的代謝途徑修飾改變代謝途徑擴展代謝途徑轉移或構建新的代謝途徑第五節(jié)微生物代謝途徑修飾的應用,第一節(jié) 微生物代謝的人工控制簡介,微生物代謝的人工控制一個嶄新的科學領域,它綜合了分子生物學、微生物學、分子反應動力學、生化工程等多個學科領域的最新成果,是目前國內(nèi)外研究的熱點；代謝工程被視為繼蛋白質(zhì)多肽單基因表

2、達的第一代基因工程、基因定向突變的第二代基因工程(即蛋白質(zhì)工程)之后的第三代基因工程。,人工控制改造后自身效率提高實例,微生物代謝酶的活性調(diào)節(jié)以酶分子結構為基礎指調(diào)節(jié)胞內(nèi)已有酶分子的構象或分子結構來改變酶活性，從而調(diào)節(jié)所催化的代謝反應的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細的調(diào)節(jié)。特點：作用直接、響應快、可逆,Allosteric regulation,微生物代謝的人工控制實例,人工控制微生物代謝的目的——,當賴氨酸和蘇氨酸都

3、積累過量時，就會抑制天冬氨酸激酶的活性，使細胞內(nèi)難以積累賴氨酸；而賴氨酸單獨過量就不會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。,,最大限度積累對人類有用的代謝產(chǎn)物,黃色短桿菌,,1、菌種的選育,2、,3、,4、,5、發(fā)酵過程（中心階段）,,6、產(chǎn)品的分離提純,,第二節(jié) 發(fā)酵工程流程,1、菌種選育的常用方法比較,基因突變,DNA重組,細胞融合,物理、化學、生物因素誘變,能大幅度改變某些性狀、操作簡便，但也具有很大的盲目性。,將目的基因導入受體細胞中，構建工程菌或工

4、程細胞。,能定向改變微生物的遺傳性狀，但操作過程復雜、要求高。,體細胞雜交等方法,能克服遠源雜交不親合的障礙，定向改變遺傳性狀。,根據(jù)不同的菌種，應選擇不同的原料配制培養(yǎng)基。配制的培養(yǎng)基應滿足微生物在碳源、氮源、生長因子、水、無機鹽等方面的營養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的PH。培養(yǎng)基的營養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。培養(yǎng)基在滿足微生物的營養(yǎng)的需求的基礎上，應盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟效益。,2、培養(yǎng)基的配制,原則有三：,3、滅菌

5、,4、擴大培養(yǎng)和接種,殺死雜菌防止雜菌與發(fā)酵菌形成競爭關系，對發(fā)酵過程造成不良影響。,擴大培養(yǎng)是將培養(yǎng)到對數(shù)期的菌體分開，分頭進行培養(yǎng)，以促使菌體數(shù)量快速增加，能在短時間里得到大量的菌體。接種時要防止雜菌的污染。,5、發(fā)酵過程： （中心階段，重點是在發(fā)酵條件的控制）,對需氧型生物保證氧的供應，對厭氧型生物控制氧的供應。 措施：控制通氣量和攪拌速度等。,加酸、加堿或加緩沖

6、液,注意降溫，使溫度控制在所培養(yǎng)微生物的最適溫度。措施：控制攪拌速度、冷卻水的循環(huán)速度等。,,6、分離 提純：,菌體：過濾、沉淀代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換,,第三節(jié) 微生物代謝的人工調(diào)控方法,1 目的 最大限度的積累對人類有用的代謝產(chǎn)物2 措施改變微生物細胞膜的通透性改變微生物的遺傳特性（誘變、重組等）控制發(fā)酵條件（如溫度、PH、O2等）,,NH4+,,抑制,葡萄糖,中間產(chǎn)物,α-酮戊二酸,谷氨酸,谷氨酸脫氫酶,

7、,,,,,,谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑,,,通過調(diào)節(jié)酶的活性，控制代謝過程,微生物代謝的人工控制—— 改變膜的透性,改變細胞膜的透性，使谷氨酸迅速排放到細胞外面，解除谷氨酸的抑制作用。,,,抑制,天冬氨酸,中間產(chǎn)物Ⅰ,,,,,,中間產(chǎn)物Ⅱ,高絲氨酸,蘇氨酸,賴氨酸,天冬氨酸激酶,高絲氨酸脫氫酶,,,,,+,甲硫氨酸,黃色短桿菌合成賴氨酸的途徑,,,高絲氨酸脫氫酶,不能合成,可以大量積累,人工誘變不能產(chǎn)生高絲氨酸脫氫

8、酶的菌種,抑制,,,,微生物代謝的人工控制—— 改變遺傳特性,O2： 如：酵母菌在有氧條件下大量繁殖，在無氧條件下才大量產(chǎn)生酒精。 又如：谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時，生成的產(chǎn)物是乳酸或是琥珀酸。C：N 如在谷氨酸發(fā)酵過程中，當培養(yǎng)基中C： N=4：1時，菌體大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；當C：N=3：1時，菌體繁殖受抑制而合成谷氨酸多,微生物代謝的人工控制—— 改變發(fā)酵條件,,第四節(jié) 微生物的代謝途徑修飾,代謝工

9、程的目的通過重組DNA技術構建具有能合成目標產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡或具有高產(chǎn)能力的工程菌，并用于生產(chǎn)。代謝工程研究的設計思路1)提高通向目標產(chǎn)物的代謝流;2)擴展代謝途徑;3)構建新的代謝途徑,一、改變代謝途徑加速限速反應改變分支代謝途徑流向構建代謝旁路改變能量代謝途徑,一、改變代謝途徑，提高通向目標產(chǎn)物的代謝流加速限速反應(通過關鍵酶的過量表達來解決代謝瓶頸) 將編碼限速酶的基因通過基因擴增 ,增加拷貝數(shù) ,在

10、宿主中表達并增強催化限速反應的酶的表達量或活性,從而提高代謝流。以實現(xiàn)目的產(chǎn)物產(chǎn)率的上升。經(jīng)典代謝工程主要過程:首先 ,必須確定代謝途徑中的限速反應及其關鍵酶。然后 ,將編碼限速酶的基因通過酶切等手段 ,制得特定片段 ,連接在高拷貝數(shù)的載體上再導入宿主中去表達,從而加速限速反應,提高目的產(chǎn)物產(chǎn)率。在頭孢霉素 C傳統(tǒng)的發(fā)酵過程中 ,青霉素N的積累表明下一步酶反應是頭孢霉素合成代謝中的限速步驟 ,通過克隆編碼限速酶(脫乙?；^孢霉素合

11、成酶)基因 cefEF,再將該重組質(zhì)粒導入頭孢霉素 C生產(chǎn)菌株頂頭孢( Cephalosporium acremonium)中 ,所得工程菌株的頭孢霉素C的產(chǎn)量提高了25 %,而青霉素N的積累量減少了15倍。,改變分支代謝途徑流向 在有競爭途徑(如分支代謝途徑)存在時,阻斷有害的或無關的競爭代謝途徑代謝產(chǎn)物的合成,從而達到改變代謝流,提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。高絲氨酸脫氫酶缺陷型(Hom2)賴氨酸工程菌芳香族氨基酸合成 頭孢

12、烷酸中 ,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三條支路上的任一條支路的酶活性被加強 ,其與另兩條支路的競爭將占據(jù)優(yōu)勢。日本 Katsumata Ryoichi 等人從谷氨酸棒桿菌 K86 中提取質(zhì)粒 pCDtrp157 ,該質(zhì)粒帶有DAHP合成酶基因和色氨酸合成酶基因。將該質(zhì)粒轉化至谷氨酸棒桿菌 KY9182(Phe2) ,使該菌可產(chǎn)色氨酸1.1 gΠL。若將苯丙氨酸合成相關的酶基因如 pheA 的基因克隆 ,則可使色氨酸生產(chǎn)菌轉化為苯丙氨酸生產(chǎn)菌

13、。,構建代謝旁路高密度培養(yǎng)技術在發(fā)酵生產(chǎn)中，為實現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng),必須阻斷或降低對細胞生長有抑制作用的有毒物的產(chǎn)生。大腸桿菌糖代謝末端產(chǎn)物乙酸達到一定濃度后明顯造成細胞生長受抑制, 人們應用代謝工程的方法,將枯草桿菌的乙酰乳酸合成酶基 因克隆到大腸桿菌中,構建新的代謝支路,結果明顯改變細胞糖代謝流,使乙酸處于較低水平,以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)目的。,改變能量代謝途徑除了通過相關代謝途徑的基因, 改變能量代謝途徑或電子傳遞系統(tǒng)也可以有效

14、改變代謝流。 重組木糖發(fā)酵菌株 SaccharomycescerevisiaeTMB3001可以在含木糖的培養(yǎng)基上生長,但其用木糖產(chǎn)乙醇率很低, 一個重要原因就是菌體內(nèi)氧化還原作用輔因子的不平衡 。因此 Thomas TMB3001 CPB. CR4兩種 Saccharomycescerevisiae菌株,通過 gdh1的敲除和 GDH2的過表達,這二者不僅能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇,而且被修飾了還原代謝系統(tǒng),C13標記葡萄糖結果顯示氨同化作用

15、從利用 NADPH變?yōu)?NADH依賴的,同時 CPB.CR4菌株的乙醇產(chǎn)率提高了25%。,二、擴展代謝途徑通過基因工程手段在宿主菌中克隆、表達特定基因(簇)等,使原有代謝途徑進一步向前或向后延伸,從而可利用新的原料用于合成目標產(chǎn)物或產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。外源基因的導入 ,通過擴展代謝途徑可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來不消耗的底物。Winter 等 克隆假單胞菌的單加氧酶基因并在大腸桿菌中表達 ,獲得的工程菌可有效降解三氯乙

16、烯 ,降解力遠大于原始菌株 ,可使三氯乙烯在水中的濃度降至 1/1000。這說明關鍵酶轉入不同的調(diào)控環(huán)境中其活性可大大增加。,三、轉移或構建新的代謝途徑轉移代謝途徑 構建新的代謝途徑一般是指引入外源基因(簇)來改造和修飾代謝網(wǎng)絡,使細胞從不能合成某種代謝產(chǎn)物轉變?yōu)槟軌蚝铣纱舜x產(chǎn)物。在真氧產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrphus)一些細菌中于限制生長和碳源過量條件下,在細胞內(nèi)大量累聚羥基丁酸(PHB)或聚羥基烷酸(P

17、HA) ,這些聚合物都具生物降解性能。為了利用大腸桿菌生產(chǎn) PHB ,有人將真氧堿菌的 PHB操縱子(包括編碼 PGB 多聚酶、硫解酶和還原的基因)克隆到大腸桿菌中,所構建的工程菌和真氧產(chǎn)堿菌一樣,當N源耗空時能積累大量 PHB ,可達細胞總量的50%。,構建新的代謝途徑A）轉移代謝途徑,即將多個特定代謝途徑中的相關基因(簇)轉移到無這些基因的菌株中,從而達到使其能合成新的目標產(chǎn)物的目的;Hopwood 等 將放線菌紅素(Actin

18、orhodin)的生物合成基因導入 Granaticin 和 Medermycin產(chǎn)生菌中 ,所構建的工程菌可積累具有新結構的抗生素Dihydrogranatirhodin 和 Mederrhodins A。b）將無關的代謝途徑相連,形成新的代謝途徑,從而合成新的目標產(chǎn)物。,代謝工程的研究目的是要改進微生物的代謝,增加工業(yè)生物產(chǎn)品的收率及生產(chǎn)能力。而如何從本質(zhì)上把握生物代謝網(wǎng)絡的調(diào)控規(guī)律，最終做到可以定量預測基因改變和環(huán)境變化后，

19、生物代謝網(wǎng)絡的變動規(guī)律，從而為優(yōu)化生物代謝功能、提高研究和生產(chǎn)效率提供堅實的理論支持和強大的技術后盾，是現(xiàn)代系統(tǒng)生物學的一個待解難題，也是代謝工程的主要任務。,第五節(jié)微生物代謝工程的應用最新進展,1、微生物代謝工程的優(yōu)缺點,優(yōu)點：方向性強、目標明確、效率高、技術手段先進、過程可控性好和重現(xiàn)性好等優(yōu)點（微生物代謝工程在修飾靶點選擇、實驗設計以及數(shù)據(jù)分析方面占有絕對優(yōu)勢）；主要缺點是對相應微生物的代謝和遺傳機理知識以及基因操作工具的依賴性

20、太強。,應用領域主要包括: (1)改善或提高微生物的某種性能; (2) 產(chǎn)生宿主細胞本身不能合成的新物質(zhì); (3)生產(chǎn)非天然的新物質(zhì)如新型藥物; (4) 對環(huán)境有害物質(zhì)的降解; (5)阻斷或降低副產(chǎn)物的生成; (6)提高菌體對環(huán)境的適應能力; (7)提高代謝產(chǎn)品生產(chǎn)速率和生產(chǎn)能力;,2、微生物代謝工程的最新應用領域,,,藥物生產(chǎn)的代謝工程與定向進化 ; 可再生資源利用的代謝工程;用代謝工程改進染料生產(chǎn)及使用;乳酸