抗體的選擇

1、抗 體 的 選 擇,其木格2010.10,主 要 內(nèi) 容,,基礎(chǔ)概念,,如何選擇二抗,,標記物的選擇,,涉及的試驗,,,,,,,,,,基礎(chǔ)概念,概 念1. 抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的糖蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（imm

2、unoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。,抗體的分子結(jié)構(gòu),輕鏈：VL、CL重鏈：VH CH1、CH2、CH3、CH4 IgG IgM IgA IgE

3、 IgD,,二、免疫球蛋白的功能區(qū),功能區(qū)：是不連續(xù)，緊密折疊的區(qū)域，由重鏈和輕鏈經(jīng)鏈內(nèi)二硫鍵連接而成的球狀結(jié)構(gòu)。該區(qū)具有特殊的功能特性。,1.類和亞類（根據(jù)H鏈的抗原性不同） IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ

4、(delta) IgE — ε(epsilon),,(1)類,(2)亞類,IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2,,,主要功能1. VL和VH是抗原結(jié)合的部位（FV區(qū)）。2. CL和CH上具有同種異型的遺傳標記。3. IgG的CH2和IgM的CH3具有補體固有成分C1q的結(jié)合點，參與激活補體系統(tǒng)。4. C

5、H3/CH4具有結(jié)合包括單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、B細胞、NK細胞等細胞的Fc段受體的功能。5. IgG的CH2+CH3 具有介導IgG通過胎盤的特性。,三、免疫球蛋白的水解片段 1. 木瓜蛋白酶（Papain）（將重鏈于近氨基端切斷） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原結(jié)合片段） Fab段可以與抗原結(jié)合，具有抗體的活性。 Fc段（fragment crysta

6、lizable，可結(jié)晶片段） Fc段不能與抗原結(jié)合，但可執(zhí)行Ig的其他生物學功能。,,2. 胃蛋白酶（Pepsin）（將重鏈于近羧基端切斷） F( ab ′)2 ：可結(jié)合2個抗原表位。 pFc ′：無生物學活性。,,,,,,,,,,,如何選擇二抗,什么是一抗二抗？,一抗是針對抗原的抗體，二抗是針對一抗的抗體。即抗體也可以充當抗原刺激機體產(chǎn)生抗體。 第一抗體就是平常所說

7、的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。 　　 第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測抗體的存在。利用抗原-抗體反應原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。,如何選擇二抗？,檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，其中如何根據(jù)一抗的種屬

8、來源和類型選擇二抗尤為重要。,1、一抗的種屬來源：,二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。,1、一抗的種屬來源：,常用的二抗產(chǎn)品包括：抗小鼠二抗（anti-mouse）、抗兔二抗（anti-rabbit）、抗山羊二抗（an

9、ti-goat）、抗綿羊二抗（anti- sheep）、抗人二抗（anti-human）、抗豚鼠二抗（anti- guinea pig）抗大鼠二抗（anti-rat）、抗豬二抗（anti-swine）、抗馬二抗（anti-horse）、抗牛二抗（anti- bovine）、抗雞二抗（anti- chicken）、抗鴨二抗（anti- duck）等。,2、一抗的類別亞型：,除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相

10、匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應的二抗也需要根據(jù)這些亞型進行選擇。,2、一抗的類別亞型：,單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎

11、所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。,2、一抗的類別亞型：,在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應物種IgG。這類型的二抗有通用的IgG（H+L）二抗，或者特異性只結(jié)合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha） Antibody、IgE的Anti

12、 IgE （epsilon） Antibody等。,,由于在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，因此除了需要考慮一抗的種屬及類型外，還需要根據(jù)后繼的檢測方案選擇不同標記的二抗，因此需要對二抗的標記物進行選擇。 按照標記分，有HRP、AP、生物素等標記二抗，F(xiàn)ITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等熒光二抗；按照檢測物種分，有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、

13、狗、牛，以及多種細菌類二抗；另外，還有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2等不同類型抗體。,3、二抗的種屬來源,一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。驢來源的二抗，非常適合

14、做類似雙標的免疫實驗。,4、二抗的耦聯(lián)標記,一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶、熒光基團、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin（生物素-親

15、和素）檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標記；而金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。,5、是否經(jīng)過血清吸附過的二抗,為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，需使用不同血清吸附的二抗。如檢測樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果對實驗的特異性要求很高，推薦經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應的IgG，因此將非

16、特異性結(jié)合降低到最低。,6、Anti-IgG還是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment,在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B細胞等細胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時候選擇二抗時最好選擇Anti-IgG, F（ab’）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應，即與IgG的Fc的F（ab’）

17、2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab’）2片段結(jié)合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此與它們也有交叉反應。,7、Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha

18、）,在一些特殊的實驗里，只需要檢測樣本里的IgG或者IgM，常規(guī)的Anti-IgG （H+L）由于與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應，而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此不能特異性的檢測某種類型的IgG或者IgM。這時候就需要針對特殊類型Ig分子的二抗。如KPL的Anti-IgG （gamma）二抗是由Anti-IgG（H+L）與IgM、IgA等吸附后的二抗，消除了能與后者結(jié)合的部分。,,,,,,,,,,標記物的選擇,偶聯(lián)到

19、二抗上的探針種類,常見二抗的應用,,HRP和AP是酶，二抗上掛了酶，要給相應的底物才能顯色，顯色方式可以通過發(fā)熒光也可以不發(fā)熒光（例如給予ECL底物，其中的H2O2和魯米諾在HRP的作用下，能在黑暗中發(fā)出熒光；也可以給予雙氧水和DAB，反應產(chǎn)生棕色不溶于水的物質(zhì)）。 熒光標記物如FITC為異硫氰酸熒光素，本身就是黃綠色熒光，二抗結(jié)合后可直接在熒光顯微鏡下觀察；生物素一般也是掛在二抗上的，利用卵白素分別連接生物素標記的第二抗體和生

20、物標記的酶，由酶催化底物，生成終產(chǎn)物，這個終產(chǎn)物也是不溶于水的。,酶,主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應用于免疫組化、western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.,,,,,,,,熒光基團,,異硫氰酸熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明菁 類 染 料藻紅蛋白或藻膽色素蛋

21、白A C M A,熒光基團,,,,,,異硫氰酸熒光素,異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）熒光標記二抗 FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物，每一個抗體可標記

22、幾個FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC的最大缺點是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。,四甲基異硫氰酸羅丹明,四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC），Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）熒

23、光標記二抗 這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團具有不同的吸收波長 （550, 570, 596nm）和最大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經(jīng)常和FITC一起在雙標記實驗中使用，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區(qū)分。,四甲基異硫氰酸羅丹明,在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆

24、蓋都很少。氪氬燈激發(fā)光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。,四甲基異硫氰酸羅丹明,因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細胞儀中用FITC作雙標，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重

25、標記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色?菁類染料,Cyanine dyes,菁類染料,菁類染料,Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。,菁類染料,Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團激

26、發(fā)光的最大波長為550nm，最強發(fā)射光為570nm。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。 Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。,菁類染料,Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大650nm，發(fā)光波長最大670nm。在

27、氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。 Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白(Phycoery

28、thrin,PE）熒光標記二抗 存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應中心，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量，供其發(fā)育生長。當藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質(zhì)變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉(zhuǎn)移光能。,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白,藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣，最大的吸收波長為566nm，最大的發(fā)射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光標記物具有以下優(yōu)點：

29、首先具有強的長波長激發(fā)和發(fā)射熒光，可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學或合成材料的多位點穩(wěn)定交聯(lián)。,AMCA,Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA） 耦聯(lián)的AMCA吸收光波長最大為350nm，發(fā)熒光則為450nm。對于熒光顯微鏡來說，AMCA可以用汞燈來激發(fā)，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號相對較弱，單標實驗中不推薦使用AMCA

30、。AMCA和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒光基團沒有或者只有極少的重疊，因此它最常用于多標記實驗中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細胞儀。,AMCA,由于人眼不能很好的檢測藍色熒光，在多標記的實驗中，AMCA耦聯(lián)的二抗應當被用于檢測大量的抗原。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。且由于肉眼不能很好的檢測AMCA所激發(fā)的藍色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。如果使用在流式細胞儀中

31、，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因為它們發(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。,熒光素根據(jù)其發(fā)射波長可分為：,,,,菁類染料（Cy2,Cy3,Cy5） TRITC,RRX,TR,,,FITC AMCA,,,,,小 結(jié),TRITC經(jīng)常和FITC

32、一起用于雙標記實驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。,常用在多標記實驗中（免疫熒光、流式細胞術(shù)），其缺點是，淬滅快，所激發(fā)的藍色熒光，肉眼不能很好的檢測。因而更適用于檢測大量存在的抗原。,Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒

33、光FITC更強。Cy3和Cy5比大多基團更亮，更穩(wěn)定，背景更弱，常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5不能用表面熒光顯微鏡觀察，用有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。,FITC是廣泛使用的熒光基團但其最大的缺點是淬滅快使用抗淬滅劑可以減輕。PE常和FITC一起用于流式細胞術(shù)雙標記實驗,!NOTE!,由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。另外，多標記中對探針色彩區(qū)分程度的要求。例如，若丹明紅-X （

34、RRX）和德克薩斯紅（TR）熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對靈敏度有更高的要求，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。 由于存在貨期，盡量推薦客戶在試驗設(shè)計時就選擇好抗體，如試驗中間需要更換，盡早定貨，以免耽誤試驗進程、影響結(jié)果。,生物素,生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/鏈酶親和素（avidin/streptavidin）發(fā)生不可逆反應而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標記的二抗，

35、在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團的avidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。,生物素,WB最好是HRP標記的二抗（即辣根過氧化物酶），因為如果用生物素標記二抗的話，還要再加三抗（HRP標記），那樣又要洗膜，又要三抗孵育，這樣時間又要延長將近兩個小時。,如何搭配流式抗體熒光標記,流式細胞儀能檢測多少個通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點：流式細胞儀有哪

36、些激光。比如標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。,,不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5

37、,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測熒光素是不一樣的。,搭配熒光素原則,搭配流式熒光素有2個原則：1、每個通道只能選擇1種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意1、每個通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明，

38、Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。,,2、各個通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素

39、就可以組合成4個顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個熒光素之間可以搭配出16種組合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(F

40、L1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等?？傊?，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導致補償過度。,,供應商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的。我們需要根據(jù)同時結(jié)合供應商能提供的每種抗體的熒光素進行搭配。原則上同一個標志的不同的克隆號帶同1個熒光素在應用上沒有區(qū)別的，但是有些不同克隆號的抗體之間可能會有一些稍微的差異，需要仔細看

41、說明書。我們可以盡量選擇在說明書上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類最多的克隆號的抗體。,,為什么某些品牌的流式細胞儀要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？因為這些熒光非常明亮，對激光非常穩(wěn)定，適合流式細胞儀的光譜性質(zhì)，對pH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時發(fā)射光譜存在巨大差異，無需補償。,,如果檢測的指標數(shù)目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，

42、首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。,1、為什么要用同型對照？,同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照，它不

43、但可以用來設(shè)定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前，染色方式如下：樣本管：一抗＋樣本同型對照管：同型對照＋樣本,2、如何選擇同型對照？,一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體，比如抗人的CD56 APC標記的抗體，貨號是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是APC標記的Mouse IgG1,κ，貨號是555751。

44、注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的。,,如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標記的二抗，那么應該選擇一抗的同型對照。比如CDw125的純化抗體，貨號是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ，貨號是555746。它的二抗PE標記的抗小鼠IgG1,貨號是550083。那么染色方式如下：樣本管： 純化的CDw25＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本同型對照管：

45、 純化的同型對照＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本,,如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里面找到不到完全相同的同型對照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標記的Mouse

46、IgG2b作為同型對照。如果最后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。,哪些客戶需要使用同型對照？,A 對流式不是非常熟悉的客戶。B 做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。C 使用不常見的標志或者特異性不高的標志的客戶，因為客戶不熟悉不常見標志的表達情況，根據(jù)同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對照可排除假陽

47、性。D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標志的客戶一般可以不使用同型對照。,為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？,首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在細胞的表面或者胞內(nèi)表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象，在細胞表面時如圖所示。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。,三、補償微球,流式細胞儀的熒光補償隔一段時間之后

48、需要調(diào)整到適合的位置。如果熒光補償沒有調(diào)節(jié)好，會導致細胞分群不明顯或者流式檢測得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會影響到檢測結(jié)果的不真實。熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)對初學者來說非常不容易掌握，同時，補償調(diào)節(jié)是流式細胞術(shù)中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標志檢測時，需要經(jīng)驗非常豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗判斷調(diào)節(jié)補償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)和圖片。,,現(xiàn)在不需要這么麻煩，因為補償微球讓一切變得更簡單。BD CompBeads是專用于流式細胞儀多色分析

49、的熒光補償調(diào)整微球。它的實用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時補償難調(diào)、耗費樣本（往往用待測樣本單標來進行補償調(diào)節(jié)）的缺點。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結(jié)合來調(diào)節(jié)補償。它不但能象待測的樣本細胞一樣在同樣的實驗條件下固定、破膜等，操作起來很簡單，靈敏度高，一致性好，使補償更輕松更準確，而且最難得的是它最適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因為這時

50、的補償往往難度較大。各型號的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時參考用。,,,,,,,,,,涉及的試驗,1、免疫組化,免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究。,1、免疫組化,實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩

51、大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。 　　 其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。,1、免疫組化,免疫組化常用的染色方法 　　根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和

52、組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。,免疫組織化學的臨床應用,主要包括以下幾方面： 　1、惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；2、確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位； 3、對某類腫瘤進行進一步的病理分型； 4、軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應用

53、多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的； 　5、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。 6、為臨床提供治療方案的選擇。,2、免疫熒光技術(shù),免疫熒光技術(shù)是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、細胞或血清中的相應抗原（或抗體）的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數(shù)領(lǐng)域。根據(jù)熒光素標記的方式不同，可分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗并不

54、直接連接熒光素，而是先將一抗結(jié)合到蛋白，然后帶有熒光素的二抗再結(jié)合至一抗。通過二抗的結(jié)合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性。,2、免疫熒光技術(shù),近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術(shù)的不斷進步，熒光檢測的靈敏度已經(jīng)接近同位素檢測的水平，直接標記的熒光抗體逐漸取代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結(jié)合至抗原，大大提高了檢測的特異性，使檢測的結(jié)果更加準確可靠。熒光檢測技術(shù)的發(fā)展，

55、使得免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM抗體，做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光抗體，對同一細胞進行多標記染色。,3．酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,酶聯(lián)免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色

56、變化來判斷試驗結(jié)果，其敏感度可達ng 水平。常見用于標記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶（AP）等。由于酶聯(lián)免疫法無需特殊的儀器，檢測簡單，因此被廣泛應用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS－ELISA。,3．酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內(nèi)，然后依次加入一抗、標記了酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡單但由于高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法

57、取代。夾心法利用二種一抗對目標抗原進行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近年來，抗原的定量檢測技術(shù)也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎(chǔ)上，開發(fā)了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術(shù)的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。,4、Western Blotting,Western Blot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Bl

58、ot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應用于檢測蛋白水平的