抗體的選擇

1、抗 體 的 選 擇,其木格2010.10,主 要 內(nèi) 容,,基礎(chǔ)概念,,如何選擇二抗,,標(biāo)記物的選擇,,涉及的試驗(yàn),,,,,,,,,,基礎(chǔ)概念,概 念1. 抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的糖蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 免疫球蛋白（imm

2、unoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。,抗體的分子結(jié)構(gòu),輕鏈：VL、CL重鏈：VH CH1、CH2、CH3、CH4 IgG IgM IgA IgE

3、 IgD,,二、免疫球蛋白的功能區(qū),功能區(qū)：是不連續(xù)，緊密折疊的區(qū)域，由重鏈和輕鏈經(jīng)鏈內(nèi)二硫鍵連接而成的球狀結(jié)構(gòu)。該區(qū)具有特殊的功能特性。,1.類和亞類（根據(jù)H鏈的抗原性不同） IgG —γ(gamma) IgA — α(alpha) IgM — μ(mu) IgD — δ

4、(delta) IgE — ε(epsilon),,(1)類,(2)亞類,IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2,,,主要功能1. VL和VH是抗原結(jié)合的部位（FV區(qū)）。2. CL和CH上具有同種異型的遺傳標(biāo)記。3. IgG的CH2和IgM的CH3具有補(bǔ)體固有成分C1q的結(jié)合點(diǎn)，參與激活補(bǔ)體系統(tǒng)。4. C

5、H3/CH4具有結(jié)合包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞的Fc段受體的功能。5. IgG的CH2+CH3 具有介導(dǎo)IgG通過胎盤的特性。,三、免疫球蛋白的水解片段 1. 木瓜蛋白酶（Papain）（將重鏈于近氨基端切斷） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原結(jié)合片段） Fab段可以與抗原結(jié)合，具有抗體的活性。 Fc段（fragment crysta

6、lizable，可結(jié)晶片段） Fc段不能與抗原結(jié)合，但可執(zhí)行Ig的其他生物學(xué)功能。,,2. 胃蛋白酶（Pepsin）（將重鏈于近羧基端切斷） F( ab ′)2 ：可結(jié)合2個(gè)抗原表位。 pFc ′：無生物學(xué)活性。,,,,,,,,,,,如何選擇二抗,什么是一抗二抗？,一抗是針對(duì)抗原的抗體，二抗是針對(duì)一抗的抗體。即抗體也可以充當(dāng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。 第一抗體就是平常所說

7、的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。 　　 第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測(cè)抗體的存在。利用抗原-抗體反應(yīng)原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標(biāo)記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。,如何選擇二抗？,檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案，因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測(cè)方案的要求，其中如何根據(jù)一抗的種屬

8、來源和類型選擇二抗尤為重要。,1、一抗的種屬來源：,二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。,1、一抗的種屬來源：,常用的二抗產(chǎn)品包括：抗小鼠二抗（anti-mouse）、抗兔二抗（anti-rabbit）、抗山羊二抗（an

9、ti-goat）、抗綿羊二抗（anti- sheep）、抗人二抗（anti-human）、抗豚鼠二抗（anti- guinea pig）抗大鼠二抗（anti-rat）、抗豬二抗（anti-swine）、抗馬二抗（anti-horse）、抗牛二抗（anti- bovine）、抗雞二抗（anti- chicken）、抗鴨二抗（anti- duck）等。,2、一抗的類別亞型：,除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相

10、匹配，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。,2、一抗的類別亞型：,單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說明書中都會(huì)有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎

11、所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專門針對(duì)這一亞類的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。,2、一抗的類別亞型：,在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG。這類型的二抗有通用的IgG（H+L）二抗，或者特異性只結(jié)合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha） Antibody、IgE的Anti

12、 IgE （epsilon） Antibody等。,,由于在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測(cè)方案的要求，因此除了需要考慮一抗的種屬及類型外，還需要根據(jù)后繼的檢測(cè)方案選擇不同標(biāo)記的二抗，因此需要對(duì)二抗的標(biāo)記物進(jìn)行選擇。 按照標(biāo)記分，有HRP、AP、生物素等標(biāo)記二抗，F(xiàn)ITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等熒光二抗；按照檢測(cè)物種分，有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉(cāng)鼠、

13、狗、牛，以及多種細(xì)菌類二抗；另外，還有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2等不同類型抗體。,3、二抗的種屬來源,一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來源的，一個(gè)是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。驢來源的二抗，非常適合

14、做類似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)。,4、二抗的耦聯(lián)標(biāo)記,一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶、熒光基團(tuán)、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗；而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用Biotin/Avidin（生物素-親

15、和素）檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。,5、是否經(jīng)過血清吸附過的二抗,為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，需使用不同血清吸附的二抗。如檢測(cè)樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高，推薦經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應(yīng)的IgG，因此將非

16、特異性結(jié)合降低到最低。,6、Anti-IgG還是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment,在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時(shí)候選擇二抗時(shí)最好選擇Anti-IgG, F（ab’）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，即與IgG的Fc的F（ab’）

17、2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應(yīng)。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab’）2片段結(jié)合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此與它們也有交叉反應(yīng)。,7、Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha

18、）,在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，只需要檢測(cè)樣本里的IgG或者IgM，常規(guī)的Anti-IgG （H+L）由于與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng)，而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此不能特異性的檢測(cè)某種類型的IgG或者IgM。這時(shí)候就需要針對(duì)特殊類型Ig分子的二抗。如KPL的Anti-IgG （gamma）二抗是由Anti-IgG（H+L）與IgM、IgA等吸附后的二抗，消除了能與后者結(jié)合的部分。,,,,,,,,,,標(biāo)記物的選擇,偶聯(lián)到

19、二抗上的探針種類,常見二抗的應(yīng)用,,HRP和AP是酶，二抗上掛了酶，要給相應(yīng)的底物才能顯色，顯色方式可以通過發(fā)熒光也可以不發(fā)熒光（例如給予ECL底物，其中的H2O2和魯米諾在HRP的作用下，能在黑暗中發(fā)出熒光；也可以給予雙氧水和DAB，反應(yīng)產(chǎn)生棕色不溶于水的物質(zhì)）。 熒光標(biāo)記物如FITC為異硫氰酸熒光素，本身就是黃綠色熒光，二抗結(jié)合后可直接在熒光顯微鏡下觀察；生物素一般也是掛在二抗上的，利用卵白素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生

20、物標(biāo)記的酶，由酶催化底物，生成終產(chǎn)物，這個(gè)終產(chǎn)物也是不溶于水的。,酶,主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟(jì)、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化、western blot和ELISA中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如ELISA和western blot.,,,,,,,,熒光基團(tuán),,異硫氰酸熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明菁 類 染 料藻紅蛋白或藻膽色素蛋

21、白A C M A,熒光基團(tuán),,,,,,異硫氰酸熒光素,異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）熒光標(biāo)記二抗 FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物，每一個(gè)抗體可標(biāo)記

22、幾個(gè)FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標(biāo)記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC的最大缺點(diǎn)是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。,四甲基異硫氰酸羅丹明,四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC），Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）熒

23、光標(biāo)記二抗 這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團(tuán)具有不同的吸收波長(zhǎng) （550, 570, 596nm）和最大發(fā)射波長(zhǎng)（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經(jīng)常和FITC一起在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區(qū)分。,四甲基異硫氰酸羅丹明,在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆

24、蓋都很少。氪氬燈激發(fā)光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激發(fā)波長(zhǎng)。,四甲基異硫氰酸羅丹明,因?yàn)镕ITC和PE可以被氬燈的488nm波長(zhǎng)激發(fā), 在流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo)，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團(tuán)要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重

25、標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單?dú)標(biāo)記染色。,菁類染料,Cyanine dyes,菁類染料,菁類染料,Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為492nm，發(fā)光為波長(zhǎng)510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲(chǔ)存后會(huì)導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。,菁類染料,Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激

26、發(fā)光的最大波長(zhǎng)為550nm，最強(qiáng)發(fā)射光為570nm。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。 Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強(qiáng)，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。,菁類染料,Cy5耦聯(lián)基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)最大650nm，發(fā)光波長(zhǎng)最大670nm。在

27、氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。 Cy5可以和很多其他的熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。由于它的最大發(fā)射波長(zhǎng)在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時(shí)采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時(shí)，不推薦使用Cy5。,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白(Phycoery

28、thrin,PE）熒光標(biāo)記二抗 存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應(yīng)中心，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量，供其發(fā)育生長(zhǎng)。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質(zhì)變得具有很強(qiáng)的熒光，能吸收不同波長(zhǎng)的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時(shí)不再接受任何外來的光，也不能轉(zhuǎn)移光能。,藻紅蛋白或藻膽色素蛋白,藻紅蛋白PE的吸收波長(zhǎng)范圍較廣，最大的吸收波長(zhǎng)為566nm，最大的發(fā)射波長(zhǎng)為574nm。藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物具有以下優(yōu)點(diǎn)：

29、首先具有強(qiáng)的長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射熒光，可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有極高的發(fā)射量子產(chǎn)率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學(xué)或合成材料的多位點(diǎn)穩(wěn)定交聯(lián)。,AMCA,Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA） 耦聯(lián)的AMCA吸收光波長(zhǎng)最大為350nm，發(fā)熒光則為450nm。對(duì)于熒光顯微鏡來說，AMCA可以用汞燈來激發(fā)，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號(hào)相對(duì)較弱，單標(biāo)實(shí)驗(yàn)中不推薦使用AMCA

30、。AMCA和熒光素的熒光波長(zhǎng)只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光的熒光基團(tuán)沒有或者只有極少的重疊，因此它最常用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀。,AMCA,由于人眼不能很好的檢測(cè)藍(lán)色熒光，在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中，AMCA耦聯(lián)的二抗應(yīng)當(dāng)被用于檢測(cè)大量的抗原。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。且由于肉眼不能很好的檢測(cè)AMCA所激發(fā)的藍(lán)色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。如果使用在流式細(xì)胞儀中

31、，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因?yàn)樗鼈儼l(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。,熒光素根據(jù)其發(fā)射波長(zhǎng)可分為：,,,,菁類染料（Cy2,Cy3,Cy5） TRITC,RRX,TR,,,FITC AMCA,,,,,小 結(jié),TRITC經(jīng)常和FITC

32、一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，也可以使用RRX或TR，但TR會(huì)產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。,常用在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中（免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)），其缺點(diǎn)是，淬滅快，所激發(fā)的藍(lán)色熒光，肉眼不能很好的檢測(cè)。因而更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。,Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒

33、光FITC更強(qiáng)。Cy3和Cy5比大多基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱，常在共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。但Cy5不能用表面熒光顯微鏡觀察，用有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。,FITC是廣泛使用的熒光基團(tuán)但其最大的缺點(diǎn)是淬滅快使用抗淬滅劑可以減輕。PE常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn),!NOTE!,由于觀察熒光需要一定波長(zhǎng)的激發(fā)光，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的儀器可發(fā)光的波段進(jìn)行選擇。另外，多標(biāo)記中對(duì)探針色彩區(qū)分程度的要求。例如，若丹明紅-X （

34、RRX）和德克薩斯紅（TR）熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對(duì)靈敏度有更高的要求，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團(tuán)探針要亮。 由于存在貨期，盡量推薦客戶在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就選擇好抗體，如試驗(yàn)中間需要更換，盡早定貨，以免耽誤試驗(yàn)進(jìn)程、影響結(jié)果。,生物素,生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/鏈酶親和素（avidin/streptavidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，

35、在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團(tuán)的avidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個(gè)位點(diǎn)上，從而極大的放大檢測(cè)信號(hào)。,生物素,WB最好是HRP標(biāo)記的二抗（即辣根過氧化物酶），因?yàn)槿绻蒙锼貥?biāo)記二抗的話，還要再加三抗（HRP標(biāo)記），那樣又要洗膜，又要三抗孵育，這樣時(shí)間又要延長(zhǎng)將近兩個(gè)小時(shí)。,如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點(diǎn)：流式細(xì)胞儀有哪

36、些激光。比如標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個(gè)熒光通道/三個(gè)顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡(jiǎn)稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測(cè)FL1-FL4四個(gè)通道/4個(gè)顏色。,,不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測(cè)熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5

37、,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測(cè)PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測(cè)的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測(cè)。Calibur和LSR都能檢測(cè)4個(gè)顏色，但是第4個(gè)通道檢測(cè)熒光素是不一樣的。,搭配熒光素原則,搭配流式熒光素有2個(gè)原則：1、每個(gè)通道只能選擇1種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意1、每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明，

38、Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個(gè)熒光素，但是我們搭配的時(shí)候只能選擇其中1個(gè)。,,2、各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細(xì)胞儀能做4個(gè)通道，在第1個(gè)原則之下，那么每個(gè)通道隨便選出1個(gè)熒光素

39、就可以組合成4個(gè)顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個(gè)熒光素之間可以搭配出16種組合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個(gè)搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(F

40、L1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等?？傊?，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個(gè)熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導(dǎo)致補(bǔ)償過度。,,供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的。我們需要根據(jù)同時(shí)結(jié)合供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素進(jìn)行搭配。原則上同一個(gè)標(biāo)志的不同的克隆號(hào)帶同1個(gè)熒光素在應(yīng)用上沒有區(qū)別的，但是有些不同克隆號(hào)的抗體之間可能會(huì)有一些稍微的差異，需要仔細(xì)看

41、說明書。我們可以盡量選擇在說明書上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類最多的克隆號(hào)的抗體。,,為什么某些品牌的流式細(xì)胞儀要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對(duì)激光非常穩(wěn)定，適合流式細(xì)胞儀的光譜性質(zhì)，對(duì)pH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時(shí)發(fā)射光譜存在巨大差異，無需補(bǔ)償。,,如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，

42、首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。,1、為什么要用同型對(duì)照？,同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對(duì)照是真正意思上的陰性對(duì)照，它不

43、但可以用來設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。在流式細(xì)胞儀上樣前，染色方式如下：樣本管：一抗＋樣本同型對(duì)照管：同型對(duì)照＋樣本,2、如何選擇同型對(duì)照？,一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比如抗人的CD56 APC標(biāo)記的抗體，貨號(hào)是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是APC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ，貨號(hào)是555751。

44、注意同型對(duì)照的成份跟它的名稱是相同的。,,如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照。比如CDw125的純化抗體，貨號(hào)是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ，貨號(hào)是555746。它的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,貨號(hào)是550083。那么染色方式如下：樣本管： 純化的CDw25＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本同型對(duì)照管：

45、 純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本,,如果沒有找到適合的同型對(duì)照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里面找到不到完全相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2а為同型對(duì)照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse

46、IgG2b作為同型對(duì)照。如果最后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。,哪些客戶需要使用同型對(duì)照？,A 對(duì)流式不是非常熟悉的客戶。B 做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。C 使用不常見的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的客戶，因?yàn)榭蛻舨皇煜げ怀Ｒ姌?biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽

47、性。D 對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的客戶一般可以不使用同型對(duì)照。,為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？,首先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象，在細(xì)胞表面時(shí)如圖所示。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。,三、補(bǔ)償微球,流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償隔一段時(shí)間之后

48、需要調(diào)整到適合的位置。如果熒光補(bǔ)償沒有調(diào)節(jié)好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分群不明顯或者流式檢測(cè)得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的不真實(shí)。熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)對(duì)初學(xué)者來說非常不容易掌握，同時(shí)，補(bǔ)償調(diào)節(jié)是流式細(xì)胞術(shù)中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標(biāo)志檢測(cè)時(shí)，需要經(jīng)驗(yàn)非常豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)判斷調(diào)節(jié)補(bǔ)償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)和圖片。,,現(xiàn)在不需要這么麻煩，因?yàn)檠a(bǔ)償微球讓一切變得更簡(jiǎn)單。BD CompBeads是專用于流式細(xì)胞儀多色分析

49、的熒光補(bǔ)償調(diào)整微球。它的實(shí)用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時(shí)補(bǔ)償難調(diào)、耗費(fèi)樣本（往往用待測(cè)樣本單標(biāo)來進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)）的缺點(diǎn)。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結(jié)合來調(diào)節(jié)補(bǔ)償。它不但能象待測(cè)的樣本細(xì)胞一樣在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下固定、破膜等，操作起來很簡(jiǎn)單，靈敏度高，一致性好，使補(bǔ)償更輕松更準(zhǔn)確，而且最難得的是它最適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復(fù)合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因?yàn)檫@時(shí)

50、的補(bǔ)償往往難度較大。各型號(hào)的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時(shí)參考用。,,,,,,,,,,涉及的試驗(yàn),1、免疫組化,免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。,1、免疫組化,實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩

51、大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。 　　 其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。,1、免疫組化,免疫組化常用的染色方法 　　根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和

52、組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。,免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用,主要包括以下幾方面： 　1、惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；2、確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位； 3、對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型； 4、軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時(shí)難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用

53、多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對(duì)軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的； 　5、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。 6、為臨床提供治療方案的選擇。,2、免疫熒光技術(shù),免疫熒光技術(shù)是利用熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）檢測(cè)組織、細(xì)胞或血清中的相應(yīng)抗原（或抗體）的方法。由于熒光抗體具有安全、靈敏的特點(diǎn)，因此已廣泛應(yīng)用在免疫熒光檢測(cè)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域。根據(jù)熒光素標(biāo)記的方式不同，可分為直標(biāo)熒光抗體和間標(biāo)熒光抗體。間標(biāo)熒光抗體中一抗并不

54、直接連接熒光素，而是先將一抗結(jié)合到蛋白，然后帶有熒光素的二抗再結(jié)合至一抗。通過二抗的結(jié)合，能將信號(hào)進(jìn)行放大，因此能在一定程度上提高檢測(cè)的靈敏度，但是隨之帶來的高背景也降低了檢測(cè)的特異性。,2、免疫熒光技術(shù),近年來，隨著熒光素和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光檢測(cè)的靈敏度已經(jīng)接近同位素檢測(cè)的水平，直接標(biāo)記的熒光抗體逐漸取代間接標(biāo)記抗體。這些標(biāo)記了熒光素的抗體直接結(jié)合至抗原，大大提高了檢測(cè)的特異性，使檢測(cè)的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。熒光檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，

55、使得免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM抗體，做為近期接觸抗原的標(biāo)志。利用單克隆熒光直接標(biāo)記抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。通過流式細(xì)胞儀，針對(duì)細(xì)胞表面不同抗原，可以同時(shí)使用多種不同的熒光抗體，對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行多標(biāo)記染色。,3．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,酶聯(lián)免疫檢測(cè)是目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測(cè)方法。該方法是將二抗標(biāo)記上酶，抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化底物的作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色

56、變化來判斷試驗(yàn)結(jié)果，其敏感度可達(dá)ng 水平。常見用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶（AP）等。由于酶聯(lián)免疫法無需特殊的儀器，檢測(cè)簡(jiǎn)單，因此被廣泛應(yīng)用于疾病檢測(cè)。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS－ELISA。,3．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,間接法是先將待測(cè)的蛋白抱被在孔板內(nèi)，然后依次加入一抗、標(biāo)記了酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標(biāo)儀）定量檢測(cè)抗原。這種方法操作簡(jiǎn)單但由于高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法

57、取代。夾心法利用二種一抗對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時(shí)大大提高了反應(yīng)的特異性。近年來，抗原的定量檢測(cè)技術(shù)也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎(chǔ)上，開發(fā)了多抗原檢測(cè)試劑盒，能同時(shí)檢測(cè)微量液相樣本中多個(gè)抗原含量。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用大大縮短了診斷的時(shí)間，提高診斷的可靠性和及時(shí)性。,4、Western Blotting,Western Blot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Bl

58、ot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的